HBSS（漢克氏平衡鹽溶液）

HBSS 屬於平衡鹽溶液，不是生長培養基。它提供細胞維持滲透壓平衡與膜電位所需的無機離子，並以葡萄糖作為立即可用的能量來源，但不含胺基酸、不含維生素、也不含蛋白質。細胞在其中可以存活數小時，卻無法生長。

這個配方源自 1940 年代開發出這組鹽類混合物的研究者 Hanks；最常被引用的文獻，是 Hanks 與 Wallace 於 1949 年發表、關於以冷藏保存組織的論文。設計意圖直接反映在組成上：漢克氏鹽類原本是為了在一般大氣條件下處理與運送組織而設計，因此碳酸氫鹽含量很低，緩衝工作主要由磷酸鹽承擔。

日常用途包括：

• 清洗：在胰蛋白酶消化、固定或裂解之前清洗細胞與單層細胞，去除血清與殘留培養基
• 潤洗：在染色或分析步驟之間潤洗
• 運送與短期暫存：組織與初代分離物的運送與短時間存放
• 稀釋：稀釋酵素、試劑與細胞懸浮液
• 分析用緩衝液：用於短時間的功能性實驗，也就是只需要葡萄糖、不需要完整培養基的場合

HBSS 刻意做得很單純，而這份單純正是它好用的原因：其中沒有任何成分會干擾下游的酵素步驟或蛋白質定量。

標準的漢克氏平衡鹽溶液配方如下：

* 不含鈣與鎂的版本會省略這幾項。

有兩項特徵決定了 HBSS 的行為。

碳酸氫鹽含量非常低——只有 350 mg/L，相較之下 RPMI 1640 為 2,000 mg/L、DMEM 為 3,700 mg/L。漢克氏鹽類是為大氣中的 CO2 濃度而配製的。HBSS 的 pH 穩定性大多來自磷酸鹽這一對成分（KH2PO4 與 Na2HPO4），它們的緩衝作用不依賴 CO2。

它含有 5.55 mM 的葡萄糖，這一點和 PBS 與 DPBS 不同。這是實質的功能差異：暫存在 HBSS 裡的細胞有能量來源，在長時間解離、組織運送與功能性分析時特別重要。這也代表 HBSS 一旦受到汙染就足以支持細菌生長，因此必須以和培養基相同的無菌規格對待。

總滲透壓接近生理值，約 280–300 mOsm/kg，工作 pH 約為 7.0–7.4。

這是最常選錯的一步，但只要把邏輯講清楚，判斷其實很直接。

二價陽離子是細胞貼附的必要條件。 鈣對於鈣黏蛋白所媒介的細胞間連接不可或缺；鈣與鎂則必須同時存在，細胞才能透過整合素貼附到培養面上。少了它們，貼附力就會下降。

想讓細胞脫離時，使用不含鈣與鎂的 HBSS。 這就是加入胰蛋白酶或其他解離試劑之前所做的那次清洗。用不含鈣鎂的 HBSS 潤洗單層細胞，一方面去除血清——血清裡的蛋白酶抑制劑會削弱胰蛋白酶的作用——另一方面也開始鬆動細胞間的連接，讓後續解離更快也更溫和。不含鈣鎂的 HBSS 同樣是 EDTA 類解離試劑的正確稀釋液，因為緩衝液中的鈣只會把 EDTA 螯合掉。

想讓細胞維持貼附且功能正常時，使用含鈣與鎂的 HBSS。 清洗還要繼續培養的單層細胞、暫存初代分離物、運送組織，以及任何牽涉訊息傳遞的功能性分析——鈣本身就是第二訊息傳遞者，不含鈣的緩衝液會扭曲影像、分泌與活化實驗的反應。許多酵素也需要二價陽離子，膠原蛋白酶就是其中之一，因此膠原蛋白酶消化應該使用含鈣鎂的版本。

一個實用的判斷原則：如果下一步牽涉酵素或活細胞的功能性量測，就用含鈣鎂的版本；如果下一步是要讓細胞脫離，就用不含鈣鎂的版本。

這三者在實務上幾乎可以互換使用，大多數時候也確實沒問題——但並非總是如此。本頁的比較表提供成分層級的對照，實務上的差別則是以下幾點。

葡萄糖。 HBSS 有（5.55 mM），PBS 與 DPBS 沒有。如果細胞要暫存超過幾分鐘，或正在被解離、運送、進行功能性量測，HBSS 的葡萄糖就是真正的優勢。但如果只是裂解前 30 秒的潤洗，那就毫無差別。

緩衝能力。 三者之中，DPBS 是最強的單純緩衝液——它的磷酸鹽總量約 8 mM，是 HBSS 約 0.8 mM 的好幾倍——在沒有 CO2 的開放實驗檯上也能穩住 pH。HBSS 靠的是較弱的磷酸鹽緩衝，加上少量碳酸氫鹽的貢獻。在 5% CO2 培養箱裡，HBSS 的碳酸氫鹽遠遠不足以穩住 pH，所以 HBSS 不適合長時間放在培養箱中。

二價陽離子。 三者都有含鈣鎂與不含鈣鎂兩種版本，選擇邏輯也完全相同。

離子細節。 HBSS 的離子輪廓比較接近培養基——它同時以硫酸鹽與氯化物的形式提供鎂，磷酸鹽負荷也比較低。DPBS 則是一種帶有高濃度磷酸鹽緩衝的生理食鹽水。這種高磷酸鹽在一種特定情況下會變成缺點：磷酸鹽會使鈣沉澱，因此含鈣的 DPBS 在長期保存或高壓滅菌後可能生成不溶性的磷酸鈣，而且磷酸鹽會干擾某些對磷酸鹽敏感的分析，以及礦化研究。

快速選擇： 裂解或固定前的潤洗，三者皆可。胰蛋白酶消化之前，選不含鈣鎂的版本——三者皆可，但慣例上用 HBSS 或 DPBS。組織運送或長時間解離，選含鈣鎂的 HBSS，就是為了那份葡萄糖。實驗檯上長時間、沒有 CO2、也沒有細胞需要餵養的步驟，選 DPBS，因為緩衝比較強。礦化或對磷酸鹽敏感的分析，選 HBSS 而不是 DPBS。

HBSS 主要靠磷酸鹽這一對成分來緩衝，再加上 4.17 mM 碳酸氫鹽的少量貢獻。磷酸鹽在 pH 7.2 附近緩衝效果良好，而且不依賴 CO2，這正是一種檯面操作用溶液所需要的性質。

由此得到的結論是：HBSS 不是培養箱用的溶液。 在 5% CO2 的環境中，溶解的 CO2 會使溶液酸化，而 4 mM 的碳酸氫鹽撐不住。放在 CO2 培養箱裡的細胞會泡在持續下降的 pH 中——這類錯誤不會造成明顯的失敗，只會造成緩慢而原因不明的存活率下降。

反過來說，HBSS 放在大氣 CO2 環境下靜置時，少量的碳酸氫鹽會以 CO2 形式緩慢逸失，pH 逐漸偏鹼。實務上這個影響很小，在 HBSS 通常的使用時間尺度內並不重要。

如果某個較長的操作需要在培養箱外仍能穩住 pH，一般的做法是使用添加 10–25 mM HEPES 的 HBSS。HEPES 在 pH 7.2–7.4 之間緩衝良好，而且不需要 CO2。取捨也一如既往：HEPES 在光照下會產生過氧化氫，且在 25 mM 濃度時對部分初代細胞具有細胞毒性。

保存。 HBSS 在 2–8 °C 下穩定，部分配方也可置於室溫——請以供應商標示為準。未開封的保存期限通常為 12–24 個月。由於含有葡萄糖，一旦受到汙染就會滋生微生物；操作務必無菌，也不要把倒出的溶液再倒回原瓶。

溫度。 清洗貼壁細胞時，請使用室溫或 37 °C 的 HBSS。冰冷的緩衝液澆在溫熱的單層細胞上會造成冷休克，可能引發脫落或膜損傷。當你刻意想讓代謝速度變慢時——例如組織運送、某些初代分離——冰冷的 HBSS 才是正確選擇，但那是一個決定，不是預設值。

不要把 HBSS 當成培養基使用。 它不含胺基酸、維生素、脂質或蛋白質。細胞可以撐幾個小時；讓細胞在 HBSS 中過夜，那是存活率實驗，不是培養。

常見錯誤：

• 在胰蛋白酶消化前用含鈣鎂的 HBSS 潤洗。 二價陽離子會維持貼附，導致解離時間拉長、需要更多酵素，對細胞的傷害也更大。
• 拿不含鈣鎂的 HBSS 當膠原蛋白酶的稀釋液。 膠原蛋白酶需要鈣，消化效果會不如預期。
• 用含鈣鎂的緩衝液稀釋 EDTA 解離試劑。 鈣會把螯合劑消耗掉。
• 把細胞留在 CO2 培養箱裡的 HBSS 中。 它的碳酸氫鹽在 5% CO2 下無法緩衝，pH 會下降。
• 以為 HBSS 和 PBS 在功能性分析中可以互換。 只要是在量測細胞、而不只是潤洗細胞，葡萄糖與離子平衡的差異就會有影響。
• 用 DPBS 做礦化研究。 它的高磷酸鹽會干擾磷酸鈣沉積的判讀；HBSS 才是比較好的選擇。