HBSS（漢克氏平衡鹽溶液）

HBSS 屬於平衡鹽溶液，不是生長培養基。它提供細胞維持滲透壓平衡與膜電位所需的無機離子，並以葡萄糖作為立即可用的能量來源，但不含胺基酸、不含維生素、也不含蛋白質。細胞在其中可以存活數小時，卻無法生長。

這個配方源自 1940 年代開發出這組鹽類混合物的研究者 Hanks；最常被引用的文獻，是 Hanks 與 Wallace 於 1949 年發表、關於以冷藏保存組織的論文。設計意圖直接反映在組成上：漢克氏鹽類原本是為了在一般大氣條件下處理與運送組織而設計，因此碳酸氫鹽含量很低，緩衝工作主要由磷酸鹽承擔。

日常用途包括：

• 清洗：在胰蛋白酶消化、固定或裂解之前清洗細胞與單層細胞，去除血清與殘留培養基
• 潤洗：在染色或分析步驟之間潤洗
• 運送與短期暫存：組織與初代分離物的運送與短時間存放
• 稀釋：稀釋酵素、試劑與細胞懸浮液
• 分析用緩衝液：用於短時間的功能性實驗，也就是只需要葡萄糖、不需要完整培養基的場合

HBSS 刻意做得很單純，而這份單純正是它好用的原因：其中沒有任何成分會干擾下游的酵素步驟或蛋白質定量。

標準的漢克氏平衡鹽溶液配方，兩種供應形式並列如下：

除此之外，兩種版本完全相同——被移除的只有那三種二價陽離子鹽類。含鈣鎂版本的鎂總量約為 0.9 mM，由硫酸鹽與氯化物兩種鹽類分攤；鈣則是 1.26 mM。這些都是標準配方數值，各家供應商並無差異，因為漢克氏鹽類是公開的標準配方，而不是誰家的專有配方。

有兩項特徵決定了 HBSS 的行為。

碳酸氫鹽含量非常低——只有 350 mg/L，相較之下 RPMI 1640 為 2,000 mg/L、DMEM 為 3,700 mg/L。漢克氏鹽類是為大氣中的 CO2 濃度而配製的。HBSS 的 pH 穩定性大多來自磷酸鹽這一對成分（KH2PO4 與 Na2HPO4），它們的緩衝作用不依賴 CO2。

它含有 5.55 mM 的葡萄糖，這一點和 PBS 與 DPBS 不同。這是實質的功能差異：暫存在 HBSS 裡的細胞有能量來源，在長時間解離、組織運送與功能性分析時特別重要。這也代表 HBSS 一旦受到汙染就足以支持細菌生長，因此必須以和培養基相同的無菌規格對待。

總滲透壓接近生理值，約 280–300 mOsm/kg，工作 pH 約為 7.0–7.4。

這是最常選錯的一步，但只要把邏輯講清楚，判斷其實很直接。

二價陽離子是細胞貼附的必要條件。 鈣對於鈣黏蛋白所媒介的細胞間連接不可或缺；鈣與鎂則必須同時存在，細胞才能透過整合素貼附到培養面上。少了它們，貼附力就會下降。

想讓細胞脫離時，使用不含鈣與鎂的 HBSS。 這就是加入胰蛋白酶或其他解離試劑之前所做的那次清洗。用不含鈣鎂的 HBSS 潤洗單層細胞，一方面去除血清——血清裡的蛋白酶抑制劑會削弱胰蛋白酶的作用——另一方面也開始鬆動細胞間的連接，讓後續解離更快也更溫和。不含鈣鎂的 HBSS 同樣是 EDTA 類解離試劑的正確稀釋液，因為緩衝液中的鈣只會把 EDTA 螯合掉。

想讓細胞維持貼附且功能正常時，使用含鈣與鎂的 HBSS。 清洗還要繼續培養的單層細胞、暫存初代分離物、運送組織，以及任何牽涉訊息傳遞的功能性分析——鈣本身就是第二訊息傳遞者，不含鈣的緩衝液會扭曲影像、分泌與活化實驗的反應。許多酵素也需要二價陽離子，膠原蛋白酶就是其中之一，因此膠原蛋白酶消化應該使用含鈣鎂的版本。

一個實用的判斷原則：如果下一步牽涉酵素或活細胞的功能性量測，就用含鈣鎂的版本；如果下一步是要讓細胞脫離，就用不含鈣鎂的版本。

這三者在實務上幾乎可以互換使用，大多數時候也確實沒問題——但並非總是如此。本頁的比較表提供成分層級的對照，實務上的差別則是以下幾點。

葡萄糖。 HBSS 有（5.55 mM），PBS 與 DPBS 沒有。如果細胞要暫存超過幾分鐘，或正在被解離、運送、進行功能性量測，HBSS 的葡萄糖就是真正的優勢。但如果只是裂解前 30 秒的潤洗，那就毫無差別。

緩衝能力。 三者之中，DPBS 是最強的單純緩衝液——它的磷酸鹽總量約 8 mM，是 HBSS 約 0.8 mM 的好幾倍——在沒有 CO2 的開放實驗檯上也能穩住 pH。HBSS 靠的是較弱的磷酸鹽緩衝，加上少量碳酸氫鹽的貢獻。在 5% CO2 培養箱裡，HBSS 的碳酸氫鹽遠遠不足以穩住 pH，所以 HBSS 不適合長時間放在培養箱中。

二價陽離子。 三者都有含鈣鎂與不含鈣鎂兩種版本，選擇邏輯也完全相同。

離子細節。 HBSS 的離子輪廓比較接近培養基——它同時以硫酸鹽與氯化物的形式提供鎂，磷酸鹽負荷也比較低。DPBS 則是一種帶有高濃度磷酸鹽緩衝的生理食鹽水。這種高磷酸鹽在一種特定情況下會變成缺點：磷酸鹽會使鈣沉澱，因此含鈣的 DPBS 在長期保存或高壓滅菌後可能生成不溶性的磷酸鈣，而且磷酸鹽會干擾某些對磷酸鹽敏感的分析，以及礦化研究。

快速選擇： 裂解或固定前的潤洗，三者皆可。胰蛋白酶消化之前，選不含鈣鎂的版本——三者皆可，但慣例上用 HBSS 或 DPBS。組織運送或長時間解離，選含鈣鎂的 HBSS，就是為了那份葡萄糖。實驗檯上長時間、沒有 CO2、也沒有細胞需要餵養的步驟，選 DPBS，因為緩衝比較強。礦化或對磷酸鹽敏感的分析，選 HBSS 而不是 DPBS。

1X HBSS 的使用範圍是 pH 7.0–7.4。 即用型 1X 溶液的出廠放行規格通常訂在 7.0–7.2 附近，部分產品的允收範圍更寬；就清洗與短期暫存而言，只要落在 7.0–7.4 這個區間，溶液的功能都是正確的。

10X HBSS 濃縮液刻意做成酸性，通常在 pH 5.8–6.1 左右。這不是瑕疵，也不需要在瓶子裡調回來。在十倍濃度下，鈣、鎂、磷酸鹽與碳酸氫鹽在中性 pH 會沉澱，所以濃縮液維持酸性，好讓這些鹽類保持溶解狀態。稀釋成 1X 之後，pH 自然會回到正常範圍。如果你量了 10X 原液、發現 pH 是 6，正在懷疑它是不是變質了——並沒有。

HBSS 主要靠磷酸鹽這一對成分來緩衝，再加上 4.17 mM 碳酸氫鹽的少量貢獻。磷酸鹽在 pH 7.2 附近緩衝效果良好，而且不依賴 CO2，這正是一種檯面操作用溶液所需要的性質。

由此得到的結論是：HBSS 不是培養箱用的溶液。 在 5% CO2 的環境中，溶解的 CO2 會使溶液酸化，而 4 mM 的碳酸氫鹽撐不住。放在 CO2 培養箱裡的細胞會泡在持續下降的 pH 中——這類錯誤不會造成明顯的失敗，只會造成緩慢而原因不明的存活率下降。

反過來說，HBSS 放在大氣 CO2 環境下靜置時，少量的碳酸氫鹽會以 CO2 形式緩慢逸失，pH 逐漸偏鹼。實務上這個影響很小，在 HBSS 通常的使用時間尺度內並不重要。

如果某個較長的操作需要在培養箱外仍能穩住 pH，一般的做法是使用添加 10–25 mM HEPES 的 HBSS。HEPES 在 pH 7.2–7.4 之間緩衝良好，而且不需要 CO2。取捨也一如既往：HEPES 在光照下會產生過氧化氫，且在 25 mM 濃度時對部分初代細胞具有細胞毒性。

保存。 HBSS 在 2–8 °C 下穩定，部分配方也可置於室溫——請以供應商標示為準。未開封的保存期限通常為 12–24 個月。由於含有葡萄糖，一旦受到汙染就會滋生微生物；操作務必無菌，也不要把倒出的溶液再倒回原瓶。

溫度。 清洗貼壁細胞時，請使用室溫或 37 °C 的 HBSS。冰冷的緩衝液澆在溫熱的單層細胞上會造成冷休克，可能引發脫落或膜損傷。當你刻意想讓代謝速度變慢時——例如組織運送、某些初代分離——冰冷的 HBSS 才是正確選擇，但那是一個決定，不是預設值。

不要把 HBSS 當成培養基使用。 它不含胺基酸、維生素、脂質或蛋白質。細胞可以撐幾個小時；讓細胞在 HBSS 中過夜，那是存活率實驗，不是培養。

常見錯誤：

• 在胰蛋白酶消化前用含鈣鎂的 HBSS 潤洗。 二價陽離子會維持貼附，導致解離時間拉長、需要更多酵素，對細胞的傷害也更大。
• 拿不含鈣鎂的 HBSS 當膠原蛋白酶的稀釋液。 膠原蛋白酶需要鈣，消化效果會不如預期。
• 用含鈣鎂的緩衝液稀釋 EDTA 解離試劑。 鈣會把螯合劑消耗掉。
• 把細胞留在 CO2 培養箱裡的 HBSS 中。 它的碳酸氫鹽在 5% CO2 下無法緩衝，pH 會下降。
• 以為 HBSS 和 PBS 在功能性分析中可以互換。 只要是在量測細胞、而不只是潤洗細胞，葡萄糖與離子平衡的差異就會有影響。
• 用 DPBS 做礦化研究。 它的高磷酸鹽會干擾磷酸鈣沉積的判讀；HBSS 才是比較好的選擇。