細胞培養中的 HEPES 緩衝液

HEPES 的全名是 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid），CAS 編號 7365-45-9，游離酸形式的分子量為 238.30 g/mol。它屬於 1960 年代由 Norman Good 及其同事提出的兩性離子緩衝液家族，這一系列緩衝液是專為生物實驗、依據一份條件清單篩選出來的：pKa 落在生理範圍、水溶性高、幾乎不穿透細胞膜、在可見光與近紫外光區吸收低、化學性質穩定，而且不太會與金屬離子形成錯合物。

這些設計條件，正是 HEPES 取代舊式有機緩衝液的原因。一種能自由穿過細胞膜的緩衝液，會連細胞質一起緩衝，干擾細胞內 pH。一種會螯合鈣、鎂、鋅或鐵的緩衝液，會把配方中的微量金屬抽走，讓細胞行為出現看起來像生物學結果的變化。HEPES 在這兩點上都表現得相當好，因此成為哺乳類細胞培養預設的補充型緩衝液。

HEPES 有兩種化學形式在販售，配製儲備液時這個差異很重要。游離酸（分子量 238.30）溶解後呈強酸性，必須用氫氧化鈉往上滴定到工作 pH。鈉鹽（HEPES-Na，分子量 260.29）溶解後呈鹼性，需要用鹽酸往下滴定。細胞培養用的現成 1 M 溶液已經滴定到 pH 7.0-7.6 區間並經過過濾除菌，省去滴定步驟，也免除隨之而來的鈉負荷不確定性。

有一點經常被誤解：HEPES 是緩衝劑，不是營養素。它對細胞代謝毫無貢獻。相對地，碳酸氫鹽既是緩衝劑也是代謝受質，供應細胞確實需要的羧化反應。這就是為什麼 HEPES 是用來補充碳酸氫鹽系統，而不是取代它。

HEPES 在 25 °C 的 pKa 約為 7.48，有效緩衝範圍大致從 pH 6.8 到 8.2。緩衝液在其 pKa 上下約一個 pH 單位的範圍內效果最好，而生理培養 pH 7.2-7.4 幾乎正好落在 HEPES 的 pKa 上。這就是使用它的全部理由：緩衝液的最大容量點，恰好就在細胞需要的位置。

實務上的麻煩在於，HEPES 的 pKa 會隨溫度變動：溫度每升高 1 °C，pKa 大約下降 0.014 個 pH 單位。後果很具體，而且經常有人栽在這裡。在 22 °C 的實驗檯上滴定到 pH 7.4 的 HEPES 溶液，等它在培養箱裡於 37 °C 達到平衡後，讀值會接近 pH 7.2。如果你的實驗依賴工作溫度下的明確 pH，就應該直接在 37 °C 滴定儲備液，或在室溫下刻意滴定到較高的設定值，並在使用前於 37 °C 確認實際數值。

供應商文獻上引用的 pKa 數字略有出入（37 °C 為 7.31、25 °C 為 7.48、20 °C 為 7.55，這幾個數值都在流通），那是因為它們是在不同溫度與離子強度下報告的。這些數值彼此並不衝突，而是同一條溫度曲線上的不同取樣點。實際操作上重要的是位移的方向與大致幅度，不是小數點後第三位。

離子強度也會讓有效 pKa 略微移動。在生理離子強度的完全培養基中，緩衝行為與表列值已經夠接近，通常不值得特別校正；但這仍然是另一個理由，說明你應該在最終配方中確認 pH，而不是只相信儲備液上的數值。

哺乳類細胞培養的工作範圍是 10-25 mM，其中 25 mM 是最常見的單一選擇，敏感的初代細胞與長時間培養則偏好 10-15 mM。超過大約 25 mM 之後效益趨於平緩，而下文討論的風險開始佔上風；50 mM 以上對許多細胞株具細胞毒性，不用於例行培養。

從 1 M 儲備液稀釋很單純：

如果你是把 HEPES 加進已經配好的完全培養基，而不是直接購買含 HEPES 的配方，有兩件事必須納入考量。

滲透壓會上升。 1 M HEPES 溶液的濃度遠高於接受它的培養基，加進去會提高總滲透壓。哺乳類培養基通常落在 260-320 mOsmol/kg，若某個配方本來就接近上限，在工作範圍的上緣加入 HEPES 就可能把它推過頭。標示「含 HEPES」販售的培養基會降低氯化鈉含量來補償；自己補充的培養基不會。如果你處理的是對滲透壓敏感的細胞，請實際量測。

鈉負荷會上升。 把 HEPES 游離酸滴定到 pH 7.4 大約需要一個當量的氫氧化鈉，因此加入 25 mM HEPES 會帶進相當量的額外鈉。在例行培養中這可以忽略；在電生理或需要嚴格控制滲透壓的工作中則不行。

加入 HEPES 時，不要把配方中的碳酸氫鈉移除。標準做法是：碳酸氫鹽維持在與培養箱設定相符的濃度，再額外加上 HEPES，兩者都在做有用的事。

幾乎所有經典培養基的預設緩衝系統，都是碳酸氫鈉搭配培養箱氣氛中的 CO2。溶解的 CO2 水合成碳酸，再解離為碳酸氫根與質子。培養基最終穩定在哪個 pH，由培養基中碳酸氫鹽濃度與溶解 CO2 濃度的比值決定，這正是配方中碳酸氫鹽含量必須與培養箱氣體設定相匹配的原因。碳酸氫鈉 3.7 g/L 的 DMEM 培養基是為 10% CO2 氣氛設計的；1.5-2.2 g/L 的配方則是為 5% CO2 設計的。把 3.7 g/L 的配方放在 5% CO2 下使用，培養基會持續偏鹼。

碳酸氫鹽系統的弱點在於，它有一半是氣體。把培養瓶拿出培養箱，CO2 就會從培養基逸散到室內空氣中，而室內空氣的 CO2 大約只有 0.04%。碳酸氫鹽留在原地，比值改變，pH 隨之上升。在層流操作櫃下，只靠碳酸氫鹽緩衝的培養基可能在十到二十分鐘內就明顯偏鹼；若培養基含酚紅，你可以親眼看著它由紅色轉向紫色。

HEPES 沒有會揮發的組成。它的緩衝容量由你加入的量決定，與周遭氣氛無關。這就是讓它有價值的那個唯一特性，也解釋了所有值得使用 HEPES 的情境。

代價是：HEPES 不提供細胞在羧化反應中會消耗的碳酸氫根，也無法重現生理上的緩衝化學。完全以 HEPES 取代碳酸氫鹽，會讓許多細胞株生長變慢或停止。幾乎在所有情況下，正確的配置都是兩者並用。

只要細胞會有一段有意義的時間離開受控的 CO2 氣氛，HEPES 就有它的位置：

• 在沒有氣體控制的載物台上做活細胞影像。 在室內空氣中進行一小時以上的縮時拍攝是最典型的情況，20-25 mM HEPES 足以在整段期間穩住 pH。
• 流式細胞術與細胞分選。 分選耗時長，樣本在環境 CO2 下待在管子裡，pH 漂移會在跑完之前就損害存活率。
• 初代組織解離。 消化作業在實驗檯的空氣中進行，常需 30 分鐘到數小時。含 HEPES 的解離液與保存液正是為此而存在。
• 活體培養物的運送。 在建築物之間移動或隔夜寄送的培養瓶沒有 CO2 供應。HEPES 搭配裝滿（而非充氣）的培養瓶是標準做法。
• 頻繁或冗長的操作。 步驟繁多的流程在操作櫃下會累積鹼性漂移；HEPES 可以把它壓平。
• 神經元與腦片實驗。 長時間的電生理與神經元保存液，正是基於同樣的理由例行使用 HEPES。

反過來說，如果培養物就是放進 5% CO2 培養箱、一週餵兩次、其餘時間不去動它，那麼 HEPES 帶來的只是成本與光化學風險，效益卻很小。它不是例行添加物，而是針對特定問題的解法。

光照問題是真實存在的，也是最常被忽略的一項。 Zigler 及其同事在 1985 年指出，在 RPMI 1640 中加入 HEPES 後，培養基暴露於可見光時會明顯增加細胞毒性產物的生成，並指認過氧化氫是主要的細胞毒性物質。這個反應只需要 HEPES 與核黃素加上光線；培養基中的其他成分並非必要。在他們的實驗中，把一半的培養基先照光三小時再加入細胞，胸苷攝取就被完全抑制。

由此得到的實務原則很簡單：HEPES 儲備液與含 HEPES 的培養基要避光保存，瓶子不要長時間放在明亮的實驗檯上，也不要在有照明的顯微鏡載物台上停留超過必要的時間；當含 HEPES 的培養基在燈光下放置後出現無法解釋的毒性時，應該把它列為第一嫌疑。幾乎每一家供應商都為 HEPES 標註「避光保存」，原因就在這裡。

濃度相關的細胞毒性。 超過 10-25 mM 的工作範圍之後，HEPES 本身對許多細胞類型就會構成問題。並沒有一個適用於所有細胞株的單一閾值；如果你要用到 25 mM 以上，請在自己的系統中以存活率讀值做滴定，而不是憑假設。

檢測干擾。 HEPES 並不是在任何情境下都化學惰性。它會參與自由基化學反應，對某些金屬氧化物可以作為還原劑，其磺酸基也可能干擾特定的蛋白質與金屬結合分析。當一項對緩衝液敏感的檢測給出意外結果時，緩衝液是合理的懷疑對象。

HEPES 不能取代無菌或穩定性措施。 它不會減緩麩醯胺酸降解，不會抑制微生物生長，也不會延長培養基的可用期限。

要從游離酸配製 1 L 的 1 M HEPES，先把 238.30 g 溶於約 800 mL 細胞培養級的水中，以氫氧化鈉（通常用 5 M 或 10 M，以減少稀釋）滴定到目標 pH，定容至 1 L，再通過 0.22 微米濾膜過濾除菌。細胞培養用的儲備液以過濾除菌優於高壓滅菌；加熱處理可能讓 HEPES 溶液變色，而且沒有任何好處足以抵銷這個風險。

影響成品品質的幾個重點：

1. 使用品質明確的水。 HEPES 儲備液會直接加進細胞賴以生存的培養基，因此水質會原封不動地帶進去。有明確低內毒素規格的細胞培養級蒸餾水才是正確的原料；內毒素含量不明的實驗室去離子水則不是。
2. 在你打算使用的溫度下滴定。 見上面的 pKa 一節。室溫讀值不等於培養箱中的數值。
3. 過濾，不要高壓滅菌。 0.22 微米，並標註日期。
4. 低溫避光保存。 液態儲備液一般保存於 2-8 °C 並避光。粉末較不敏感，通常在室溫下避光保存即可。
5. 留意內毒素。 緩衝液是內毒素進入培養系統中常見、卻很少被檢查的途徑。如果你的工作對內毒素敏感（初代免疫細胞、幹細胞，或任何朝法規應用發展的項目），請使用有明確內毒素規格的儲備液，而不是用規格不明的試劑自行配製。

對於要用粉末大量配製培養基的實驗室來說，購買 HEPES 粉末自行滴定，每莫耳成本比購買無菌 1 M 溶液便宜得多。對於一次只補充幾瓶完全培養基的實驗室，無菌 1 M 溶液才是務實的選擇：不用秤重、不用滴定、不用過濾，也沒有機會用自製的儲備液污染一整批培養基。