台盼藍與染料排除存活率分析

台盼藍（CAS 72-57-1，C34H24N6Na4O14S4，分子量 872.88 g/mol）是一種雙偶氮染料，最早是為了染錐蟲而開發，名稱也由此而來。在細胞培養裡，它只負責一件事：把細胞膜完整的細胞和細胞膜不完整的細胞分開。

這個染料帶有四個磺酸基，在生理 pH 下帶強烈負電。這份電荷就是整個分析的全部基礎。健康的細胞膜對這種體積大、帶四價負電的分子幾乎完全不通透，因此染料被排除在外，細胞內部維持不染色。一旦細胞膜完整性喪失，染料就會自由進入並結合細胞內的蛋白質，在明視野照明下讓細胞呈現明顯的藍色。

這也是為什麼這項技術正確的名稱是染料排除分析，而不是存活率分析。真正被量到的，是細胞膜對染料的排除能力。存活率是從這個量測推論出來的，而推論與量測之間的落差，正是大多數台盼藍錯誤的來源。

在顯微鏡下，未染色的存活細胞看起來明亮、渾圓、有折光性，邊緣帶一圈清晰的光暈。死細胞則呈現扁平、深藍，常常略為腫脹，並失去折光的邊緣。這個對比強烈到用肉眼在 100x 放大倍率下就能判讀，這也是這個方法自 1920 年代以來幾乎原封不動沿用至今的主要原因。

細胞計數用的台盼藍以 0.4%（w/v）溶液供應——也就是 4 mg/mL——幾乎都配在等滲透壓的緩衝液中（常見配方為 0.81% 氯化鈉與 0.06% 磷酸鉀），並以 0.22 um 濾膜過濾除菌。

0.4% 這個數字是實務上的折衷，而不是什麼物理常數：

• 濃到足以快速判讀。 在 0.4% 之下，死細胞在混合後幾秒內就達到飽和的顏色深度，操作者不必等染色慢慢顯現。
• 淡到看得穿。 台盼藍顏色極深。濃度只要明顯高於 0.4%，計數槽的背景就會暗到讓未染色細胞失去對比，小細胞也變得難以找到。
• 配合標準的 1:1 稀釋。 因為流程是把等體積的樣本與染料混合，細胞實際上處在 0.2% 的染料中。原液供應濃度定在 0.4%，稀釋倍數的計算就剛好是乾淨的 2 倍。

有些流程會針對很小的細胞，或針對光學系統靈敏的自動計數儀，改用 0.2% 或 0.1% 的台盼藍。一旦更動染料濃度，計算式裡的稀釋倍數也要跟著改，而且與歷史數據的比較就不再成立。

溶液請存放於室溫或 2-8 C，避光保存。台盼藍溶液放久了會形成細小沉澱，冷藏後尤其明顯；若看到懸浮顆粒，使用前請以 0.2 um 針筒過濾器過濾，因為染料結晶很容易被誤判為小型死細胞或碎屑。

以下是使用改良型 Neubauer 血球計數盤的標準手動流程。熟練之後，每個樣本大約五分鐘。

開始之前。 用 70% 乙醇與無棉絮拭紙清潔計數盤與蓋玻片。把蓋玻片壓在計數槽上，直到接觸邊緣出現牛頓環——也就是淡淡的彩虹狀干涉條紋。條紋出現代表蓋玻片已經座落在正確的 0.1 mm 高度，而這正是體積計算成立的前提。

1. 製備單細胞懸浮液。 貼壁培養請以 trypsin-EDTA 解離、中和，再輕柔吹打打散細胞團。細胞團塊是手動計數最大的誤差來源，因為八顆細胞黏成一團只會被算成一個物體。
2. 取具代表性的樣本。 把懸浮液充分混勻但不要打出泡沫，然後立刻取出一份。細胞在一兩分鐘內就會沉降；從靜置的管子裡吸出來的樣本無法代表整個培養。
3. 與染料 1:1 混合。 取 10 uL 細胞懸浮液與 10 uL 0.4% 台盼藍混合，稀釋倍數即為 2。以輕柔吹打的方式混勻。
4. 要等，但別等太久。 讓混合液靜置約 1 分鐘。計數前不要超過 3-5 分鐘。台盼藍具有細胞毒性，存活的細胞會隨著靜置時間逐漸吸入染料，樣本放得愈久，存活率讀值就愈低。同一個樣本在 15 分鐘時判讀，可能比在 2 分鐘時低上好幾個百分點。
5. 上樣。 把 10 uL 滴入蓋玻片邊緣的缺口，讓毛細作用一氣呵成地填滿計數槽。不要溢流到溝槽裡，也不要帶入氣泡。若計數槽淹了，就清洗後重新上樣。
6. 讓細胞沉降約 30 秒，再以 100x 總放大倍率觀察。
7. 計數四個大角落方格。 每個角落方格為 1 mm x 1 mm，蓋玻片位於其上方 0.1 mm 處，因此每格圍出 0.1 mm3 = 1 x 10^-4 mL。染色與未染色的細胞要分開計數。
8. 套用一致的邊界規則。 碰到上方與左側邊界線的細胞算，碰到下方與右側的不算。任何規則都可以，只要一致使用即可，因為它的目的只是避免同一顆細胞在相鄰兩格被重複計算。
9. 確認計數落在合理範圍。 目標是每個角落方格 20-50 顆細胞。低於約 20 顆時，卜瓦松計數誤差會變得很大；高於約 100 顆時細胞會重疊而被少算。若落在這個範圍之外，請稀釋或濃縮樣本後重做。

計算方式：

``` 細胞數/mL =（每個角落方格的平均計數）x（稀釋倍數）x 10^4

存活率 % =（未染色細胞 / 總細胞數）x 100 ```

式中的 10^4 是把 1 x 10^-4 mL 的計數槽體積換算成每毫升的數值。它是血球計數盤幾何結構的固定性質，不是可以調整的參數。

實例計算。 四個角落方格的未染色細胞數為 42、38、45 與 39，染色細胞數為 3、2、4 與 3。

• 每格平均總細胞數 =（45 + 40 + 49 + 42）/ 4 = 44
• 每格平均未染色細胞數 = 41
• 總細胞數/mL = 44 x 2 x 10^4 = 8.8 x 10^5 細胞/mL
• 活細胞數/mL = 41 x 2 x 10^4 = 8.2 x 10^5 細胞/mL
• 存活率 = 164/176 x 100 = 93.2%

若需要更好的精確度，請把計數盤兩側都數過再取平均。單次總數 100 顆的計數，光是卜瓦松統計本身就帶有約 10% 的誤差，這還沒算上操作者與取樣造成的誤差。

自動台盼藍計數儀跑的是完全相同的化學反應，只是把操作者的眼睛換成影像分析。樣本一樣與 0.4% 染料 1:1 混合，加到拋棄式載玻片或可重複使用的匣槽中，再由明視野影像切割出物體，依大小、圓形度與光學密度加以分類。

自動化真正解決的，是操作者之間的變異，以及整盤樣本逐一計數的枯燥。兩位分析人員判讀同一片載玻片，存活率經常差上好幾個百分點，而且這種差異是系統性的——有些人就是比較願意把偏淡的細胞判為死亡。

自動化解決不了的，是上游的任何問題。它拆不散細胞團塊，也沒辦法把不具代表性的樣本變得有代表性。它還帶有一個特有的失效模式：與小細胞尺寸相近的碎屑、染料結晶與細胞碎片，會被分類成細胞。狀況不佳、碎片滿佈的培養，很可能得到明顯偏高的自動計數值與偏低的存活率。

實務建議：

• 針對你的細胞類型設定並記錄尺寸門檻，並在整個實驗中固定不變。改動門檻就會改動答案。
• 新機器或新細胞株上線前，請用同一批樣本與手動計數比對，確認之後再信任它。
• 把存活率低於大約 70-80% 的情況視為自動分類品質下降的區間，因為瀕死細胞的大小與染色深度會落入中間地帶。
• 對於碎屑多的樣本、初代細胞或血液來源樣本，使用吖啶橙搭配碘化丙錠的螢光式計數儀，準確度遠高於明視野台盼藍，因為核酸染劑會忽略所有不含 DNA 的東西。

台盼藍排除法快速、便宜，用於例行繼代綽綽有餘。但它作為培養健康度的指標確實不可靠，而背後的原因值得理解，因為那決定了你什麼時候該換一種分析方法。

它只偵測得到晚期死亡。 細胞膜完整性喪失是細胞死亡過程中最後才發生的事件之一。一顆已經走上凋亡的細胞——caspase 已活化、DNA 正在斷裂、粒線體已通透化——仍然可以好幾個小時都把台盼藍排除在外。一個判讀為 95% 存活的培養，可能含有相當比例的凋亡細胞，明天就會全部死掉。這是最具影響力的單一限制。如果你在量測細胞毒性處理的效果，台盼藍會低估作用強度，而且在早期時間點低估得最嚴重。

它不是增殖或功能分析。 以染料排除判定為存活的細胞，可能已經停止生長、已經老化，或者無法再產生你要的蛋白質。細胞膜完整與否，完全說不出一顆細胞還能不能做事。

死細胞會消失。 已經完全裂解或崩解的細胞根本不會被算進去。一個持續衰退好幾天的培養，狀況最差的細胞早已解體，於是存活下來的族群看起來反而健康得可疑。已經崩壞的培養所測出的存活率，是一個帶有倖存者偏差的數字。

染料本身就會殺細胞。 長時間接觸會拉低實際樣本的存活率讀值。這正是 3-5 分鐘這個時間窗重要的原因，也是一批樣本應該一個一個染、而不是全部一起染的原因。

蛋白質會結合染料。 台盼藍會結合血清蛋白，因而拉高背景染色、降低對比。高血清培養基中的樣本，尤其是腹水或裂解液這類富含蛋白質的樣本，判別度會明顯變差。染色前先換到 PBS 中可以改善判讀。

判讀帶有主觀性。 在受壓的培養中，部分染色、呈淡藍色的細胞很常見，不同操作者的判法也不同。請事先決定淡藍算不算死亡，寫下來，然後一致執行。

樣本量少或存活率低時效果很差。 手動計數大約需要 1 x 10^5 細胞/mL 才能落在有用的計數區間，而且在兩個極端下精確度會急遽下降。

讓分析方法對上你的問題。台盼藍回答的是「我手上有多少細胞、其中多少已經死了」。它回答不了「這個化合物是不是在殺我的細胞」或「這個培養健不健康」。

• 例行繼代與接種密度。 用台盼藍。快速、便宜，一次操作就同時給出濃度與存活率。
• 細胞毒性與劑量反應。 用代謝型分析（刃天青、MTT/XTT）或 ATP 冷光分析。這些方法遠在細胞膜破裂之前就能偵測到功能衰退，而且提供適合擬合 IC50 的連續讀值。
• 區分細胞凋亡與壞死。 用流式細胞儀搭配 Annexin V 與碘化丙錠。Annexin V 偵測磷脂醯絲胺酸外翻到膜外側，那是很早期的事件；碘化丙錠則要等到細胞膜失效之後才進得去。兩者合用可以分出早期凋亡、晚期凋亡與壞死族群，這是任何單一染劑做不到的。
• 初代細胞、血液製品、碎屑多的樣本。 用螢光核酸染色，通常是吖啶橙搭配碘化丙錠，在自動計數儀上進行。DNA 專一性染劑會忽略血小板、紅血球與碎屑，那些正是明視野計數的干擾源。
• 細胞治療產品或生物製程收穫液的放行檢驗。 通常需要一種以上的正交方法，因為細胞膜完整性本身並不被接受為產品具功能性的充分證據。

在生物反應器或製程開發的場景中，整個批次期間追蹤的台盼藍存活率仍然是有用的趨勢指標。絕對數值沒那麼重要，曲線的形狀才重要；存活率開始往下走就是真實訊號，即使它的絕對值偏樂觀也一樣。

存活率遠低於預期。 先檢查染色到計數之間隔了多久——這是最常見的原因。接著檢查胰蛋白酶消化：過度消化會直接破壞細胞膜。確認培養基與 PBS 有回溫；冷休克與緩衝液不匹配造成的滲透壓逆境，都會表現為排除能力下降。最後檢查染料是不是已經過了可用期限或嚴重沉澱。

培養看起來很糟，存活率卻高得不合理。 懷疑上面提到的倖存者效應——完全裂解的細胞不會被計數。解離之前先在顯微鏡下看看培養：漂浮的碎屑，還有顆粒化、出現空泡的貼壁細胞，透露的訊息比那個數字更多。可以考慮改做代謝型分析。

重複樣本之間的計數無法重現。 幾乎都是團塊或取樣問題。把懸浮液吹打到真正的單細胞狀態，每次取樣前立刻混勻，並確認計數是否在多次重複之間逐次下滑，那代表細胞正在管子裡沉降。

細胞看起來灰灰的，不是清楚的藍色或透明。 通常是過量蛋白質結合了染料。把細胞洗到 PBS 中再重新染色。同時檢查蓋玻片是否確實座好，聚光鏡是否調到良好的明視野對比。

計數槽填充不均，或細胞堆在一邊。 蓋玻片沒座好，或是上樣過量。清潔、乾燥、重新壓合到牛頓環出現為止，再以一次平順的毛細填充重新上樣。

自動計數儀與手動計數不一致。 檢查尺寸門檻，以及輸入儀器的稀釋倍數。拍一個視野，直接檢視分類疊圖——大多數儀器都會告訴你它把什麼當成了細胞，而答案往往是碎屑。

台盼藍是實驗室試劑，不是治療用材料，應該當作具有已知危害的化學品來處理。由於結構上與聯苯胺衍生的偶氮染料有關，它在數個法規轄區被列為疑似致癌物與生殖毒性物質。請戴手套、穿實驗衣操作，從粉末配製溶液時請在生物安全櫃內或通風良好的環境下進行，染過的廢棄物請依當地規定當作化學廢棄物處理，不要倒進水槽。

溶液本身的處理原則：

• 存放於室溫或 2-8 C，避光保存。
• 若看得到沉澱，使用前以 0.2 um 過濾。
• 使用過濾除菌的產品，是為了避免計數樣本汙染重複使用的計數槽，而不是因為這項分析本身需要無菌——染過的細胞反正都要丟棄。
• 不要把用剩的染色樣本倒回原瓶。

一瓶 100 mL 的溶液，以每次計數消耗 20 uL 計算，可支持數千次計數，因此決定何時更換的通常是保存期限，而不是用量。