ACK 溶血緩衝液

ACK 溶血緩衝液的化學組成十分單純：水中溶有三種溶質，並調整至生理 pH 值。

標準 1X ACK 溶血緩衝液，每 1 公升配方

以 0.22 微米濾膜過濾除菌。避光保存於 2-8 °C；若產品標示為常溫保存，則存放於 15-30 °C。請務必確認標籤，因為市售 ACK 兩種保存條件都有。

市售配方之間確實存在細微差異，而且這些差異是真實的。 Lonza 公開的使用說明書指定 NH4Cl 為 8,024 mg/L、KHCO3 為 1,001 mg/L、EDTA.Na2.2H2O 為 3.722 mg/L，其中 EDTA 含量比多數已發表配方所用的 0.1 mM 低了十倍。Gibco 的 ACK 溶血緩衝液規格為 pH 7.0-7.7、滲透壓 280-320 mOsmol/kg，氯化銨含量也常標示為 155 mM 而非 150 mM。這些差異都不足以改變緩衝液的實際表現，但若您要完整重現某篇已發表方法，請使用該方法採用的配方，不要假設所有 ACK 都一樣。

EDTA 是最常被問到的成分。它在此處的濃度只達到螯合作用，而非溶血作用：它結合二價陽離子，避免陽離子依賴性的細胞聚集，讓白血球懸浮液維持單細胞狀態。它對溶血本身幾乎沒有貢獻，溶血完全由氯化銨驅動。

關於「10X」的疑問。 ACK 通常以 1X 濃度供應並以 1X 使用。部分供應商販售 10X 濃縮液，使用前必須以水稀釋。10X 儲備液並非等張溶液，絕對不可未經稀釋直接加到細胞上。

ACK 的選擇性並不是因為紅血球比較脆弱，而是來自兩種蛋白質：成熟紅血球大量帶有這兩種蛋白，白血球則沒有。

溶液中的氯化銨與氨、質子處於平衡狀態。不帶電的氨可自由穿過紅血球膜；進入細胞後結合一個質子形成銨離子，消耗細胞內的質子，使碳酸酐酶所催化的二氧化碳與碳酸氫根之間的平衡發生偏移。紅血球內碳酸酐酶活性極高，因此這個平衡反應非常快。

生成的碳酸氫根接著由帶 3 蛋白（band 3／AE1，紅血球的陰離子交換蛋白）與細胞外的氯離子交換。帶 3 蛋白在每顆紅血球上約有一百萬個拷貝，催化電中性、一對一的碳酸氫根／氯離子交換。這個迴路稱為 Jacobs-Stewart 循環，其淨結果是氯化銨在細胞內持續累積。滲透作用驅使水分隨之進入，細胞膨脹，細胞膜最終破裂。

白血球既沒有那麼高的碳酸酐酶活性，也沒有足夠的帶 3 蛋白密度，無法以任何可觀的速率運行這個迴路。它們會吸收部分氨，細胞內 pH 值出現短暫上升，但在流程進行的短短數分鐘內，累積溶質的速度不足以讓細胞膨脹破裂。這正是時間如此關鍵的原因：在 ACK 中，紅血球與白血球的差別是動力學上的，而非絕對的。放得夠久，白血球一樣會受害。

由這個機制可直接推出兩個結論。第一，室溫下的溶血比在冰上快，因為迴路中的每一個步驟都受溫度影響；緩衝液太冷是溶血看起來不完全最常見的原因。第二，白血球所經歷的短暫細胞內鹼化並非沒有生物意義。對細胞質 pH 值敏感的功能性測定，例如鈣離子流動、呼吸爆發或吞噬作用試驗，密度梯度分離往往比氯化銨溶血更安全。

這是 ACK 當初設計的標準應用。以下體積是以一顆成年小鼠脾臟為準。

1. 製備單細胞懸浮液。 用注射器推桿把組織在冰冷的 PBS 或無血清培養基中壓過 70 微米細胞篩網，並沖洗篩網。
2. 離心收集細胞。 於 4 °C、300-400 x g 離心 5 分鐘。將上清液完全吸除；殘留的上清液會稀釋溶血緩衝液並減慢反應。
3. 以 ACK 重新懸浮。 每顆脾臟加入 1-3 mL 的 1X ACK 溶血緩衝液。Lonza 的說明書給出適用於任何細胞沉澱的通則：加入的 ACK 體積應與細胞沉澱的體積相當。輕柔且完全地重新懸浮——結塊會導致溶血不均勻。
4. 靜置作用。 室溫下 1-5 分鐘，期間輕柔混合。Lonza 的流程指定將試管旋搖 30-60 秒。許多實驗室會直接觀察懸浮液，一旦顏色由不透明的紅色轉為澄清透明的紅色就立刻停止，通常需要 1-2 分鐘。不可超過 5 分鐘。
5. 以稀釋終止反應。 立即以 PBS 或無血清培養基把試管補滿至至少 10 倍體積。終止 ACK 的是稀釋，不是中和。
6. 清洗。 以 300 x g 離心 5 分鐘，棄去上清液。此時細胞沉澱應呈白色或淡粉紅色。
7. 必要時重複。 若細胞沉澱仍明顯偏紅，將步驟 3-6 再重複一次。脾臟需要第二輪是正常的；需要第三輪則代表前面某個環節出了問題，多半是重新懸浮不完全或緩衝液太冷。
8. 過濾與計數。 通過 40-70 微米篩網去除碎片與溶解細胞形成的聚集物，再以錐蟲藍計數後進行後續操作。

骨髓 採用相同流程，但作用時間較短，通常為 30-90 秒，因為紅血球負荷較低。

白血球層與稀釋全血 相對於樣本量需要更多緩衝液，作用時間也更長，通常在室溫下 5-10 分鐘，每單位體積的壓積細胞使用 10-20 倍體積的 ACK。各廠牌對全血的說法並不一致：Gibco 把 EDTA 抗凝全血列為適用樣本類型之一，而 Lonza 的使用說明書則明確指出該產品不可用於全血溶血。請依照您實際購買的產品所附說明書操作。

溶血不完全——細胞沉澱仍是紅色。 依常見程度排序的原因：緩衝液太冷或直接從冰箱取出使用（請先回溫至室溫）；細胞沉澱未完全打散，留下緩衝液接觸不到的結塊；相對於紅血球負荷，緩衝液用量太少；殘留上清液太多，把緩衝液稀釋了；緩衝液過期或反覆凍融。殘留的紅血球不只是外觀問題——它們會阻塞流式細胞儀的流路、干擾自動計數，並在後續製備中增加碎片。

過度溶血——存活率下降、產量減少。 最常見的操作錯誤就是把細胞放在 ACK 中太久。超過約五分鐘後，白血球開始膨脹死亡，顆粒球最先受到影響，表面抗原決定位也可能流失或改變到足以影響流式細胞術染色的程度。若新鮮脾臟製備物在溶血後的存活率低於 85-90%，而組織處理過程並無問題，溶血這一步就是第一個該檢查的地方。

溶血後細胞聚集。 通常是溶解細胞釋出的游離 DNA 造成的。在清洗步驟中加入 DNase I，或在清洗緩衝液中加入 EDTA，一般即可解決。最後一次清洗後立刻以 40 微米篩網過濾，可去除已經形成的聚集物。

後續的酵素反應失效。 從溶血緩衝液帶入的 EDTA 會螯合鈣與鎂，抑制您接下來使用的任何二價陽離子依賴性酵素——限制酶、某些緩衝系統中的聚合酶，尤其是膠原蛋白酶與 dispase。在任何酵素步驟之前，請以含二價陽離子的緩衝液清洗兩次，並且絕對不要把 ACK 處理過的細胞直接送進 dispase 或膠原蛋白酶消化。

功能性測定結果異常。 前述短暫的細胞內鹼化可能改變活化狀態、鈣離子調節與呼吸爆發的測定結果。若功能性讀值與流式細胞術的表現型不一致，請先與同一供體以密度梯度分離的細胞比較，再下任何生物學上的結論。

數天後才出現汙染。 ACK 是單純的水溶液，沒有抗菌活性，也沒有防腐劑。若以未經過濾的水自行配製，或反覆從共用瓶中分倒，它就會成為汙染進入原本乾淨製備物的便利途徑。請以 0.22 微米過濾除菌、分裝保存，並以對待培養基的相同標準處理它。

氯化銨對皮膚、眼睛與呼吸道具刺激性，吞食有害。在此處使用的濃度下溶液相當溫和，但固體並不溫和，秤量時會產生粉塵。請在化學排氣櫃內或有局部抽氣的位置秤量，配戴護目裝備，避免吸入粉末。

切勿把氯化銨溶液與次氯酸鹽漂白水混合。 這是這個原本相當溫和的試劑唯一真正嚴重的危害。銨鹽與次氯酸鹽反應會生成氯胺氣體，吸入具毒性。以漂白水處理廢液抽吸瓶的實驗室必須知道：ACK 廢液進入裝有漂白水的收集瓶，是真實存在的氯胺風險。請把氯化銨廢液分開處置，或在它接觸任何次氯酸鹽之前先以大量清水稀釋。

基於相同的化學原理，與強鹼接觸會釋出氨氣。

內毒素對免疫學研究很重要。 ACK 幾乎只用於免疫細胞，而免疫細胞正是對脂多醣汙染最敏感的細胞。以內毒素含量不明的實驗室去離子水配製的緩衝液，可能會活化或預先激發您正要分析表現型的那些細胞，而其效應看起來就像真實的生物現象。請使用有標示內毒素規格的細胞培養級用水；若進行功能性免疫學實驗，請使用有明確內毒素限值的市售緩衝液。

保存與穩定性。 配製並過濾之後，ACK 在冷藏避光的條件下可穩定數個月。市售 1X 緩衝液的保存期限通常為 12 個月。不要反覆凍融。任何出現混濁或產生顆粒的瓶子都應丟棄。

ACK 並不是去除紅血球的唯一方法，也不總是最好的方法。

低張（純水）溶血 依據相同的滲透原理，但手法粗糙：短暫暴露於蒸餾水中，再以高濃度食鹽水恢復張力。它便宜，除了水與 10X PBS 之外不需要其他試劑，但溶解紅血球與傷害白血球之間的操作窗口比 ACK 窄得多，不同操作者之間的再現性也差。它主要是作為備用方案而留存下來。

密度梯度分離（Ficoll-Paque、Percoll、Lymphoprep）依浮力密度同時移除紅血球與顆粒球，而不是把任何細胞溶解掉。它比較溫和，不會讓白血球接觸銨離子，也不會造成細胞內 pH 值的變化，是功能性測定的正確選擇。代價是耗時、每個樣本的成本較高、若您需要顆粒球則會流失，而且這項技術要在大量樣本下穩定重現比較困難。

市售的固定溶血試劑 用於臨床流式細胞術，在同一個步驟中溶解紅血球並固定白血球。它們非常適合全血的免疫表現型分析，但若您之後需要活細胞就毫無用處。

完全不溶血 在後續方法能夠容忍紅血球時是合理的選項——例如某些磁珠分選就完全不受影響。

就 ACK 原本設計的用途而言，也就是製備可存活的小鼠脾臟細胞或骨髓細胞供培養、分選或過繼性轉移使用，ACK 仍然是標準做法：快速、便宜、夠溫和，而且只要嚴守時間就有再現性。