細胞培養污染

把細胞培養污染分成兩群來看是有意義的，因為這兩群需要完全不同的實驗室應對方式。

看得見的一群 —— 細菌、酵母菌與絲狀真菌 —— 生長快速、會改變培養基，通常在一到五天內就相當明顯。這一類用看的就找得到。它們很惱人，但會自己現形；真正該問的不是「這是什麼」，而是「它是怎麼進來的」，因為答案幾乎都是無菌操作上某個具體、可以修正的破口。

看不見的一群 —— 黴漿菌、病毒污染，以及與身分錯誤細胞株之間的交叉污染 —— 不會產生混濁、不會變色，也沒有任何看得到的線索。這一類只有刻意檢測才找得出來，而正因為它們沉默無聲，對實驗結果的破壞反而更大。身分錯誤的細胞株或黴漿菌陽性的細胞株，會持續產出乾淨、可重現、卻指向錯誤對象的數據。

還有第七類值得單獨點名：化學性污染 —— 內毒素、清潔劑殘留、從管線溶出的塑化劑、金屬離子，或某項規格不符的培養基成分。它不是生物，看不見，卻正好會製造出最常被歸咎為「細胞狀態不好」的那些症狀：生長變慢、貼壁不良、長不到預期的匯合度。

外觀。 培養基變得混濁或霧濁，通常在污染事件發生後的 24–72 小時內出現。若培養基含酚紅，大量的好氧或兼性菌會使 pH 下降，培養基由紅橙色轉為黃色。在相位差顯微鏡 200–400× 下，細菌呈現為極小的桿狀、球狀或球桿狀，直徑約 0.5–1 µm、長度最多約 20 µm，在細胞之間移動，可見明顯的布朗運動；具運動性的菌種則呈現方向性游動。貼壁細胞之間出現前一天還沒有的閃爍顆粒狀背景，就是最典型的第一個徵兆。

常見來源。 操作技術 —— 手部、袖口、在開口容器上方交談、把未消毒的物品從開口燒瓶上方遞過去。受污染的水浴槽與培養箱水盤。未過濾或過濾方式不正確的添加物。多株細胞共用同一瓶已受污染的試劑。

處理方式。 直接丟棄。容器離開無菌操作櫃之前先高壓滅菌或消毒。不要試圖用抗生素搶救已遭細菌污染的培養瓶：即使可見的生長被壓下去，低量存活的菌體與其內毒素負荷仍然存在，你只是把一個明顯的問題換成一個隱藏的問題。

外觀。 酵母菌在顯微鏡下呈現為離散的卵圓形或球形顆粒，一般為 3–5 µm，因此明顯大於細菌，而且常可看見出芽 —— 較小的子細胞附著在較大的母細胞上。出芽是最有用的單一辨識特徵。

培養基會轉為混濁，但通常比細菌慢，而且往往要等到污染已相當嚴重才看得出來。它的 pH 表現很有特色，值得記住：酵母菌在污染量大之前幾乎不改變 pH，等到污染嚴重時，pH 通常是上升而不是下降。培養基已經混濁、酚紅卻偏粉紫色而不是黃色，那多半是酵母菌而不是細菌。

常見來源。 空氣傳播 —— 酵母菌在一般環境中大量存在，因此氣流受損的操作櫃、保養不良的 HEPA 濾網，或在櫃外進行的操作，通常就是答案。皮膚與毛髮。受污染的水浴槽。

處理方式。 丟棄。接著檢查操作櫃：做氣流驗證、檢查濾網，並確認沒有人把玻璃門開在錯誤的高度作業。

外觀。 絲狀真菌是所有污染中視覺上最明顯的。顯微鏡下，菌絲體呈現為細長、如絮狀的分枝菌絲橫越視野，有時伴隨較緻密的孢子團塊。肉眼可見的部分先是白色、黃色、灰色或黑色的小絨點，漂浮在培養基中或附著在液面處的瓶壁上，數天內就發展成大片毛絨狀斑塊。培養基通常比細菌污染時清澈得更久，隨著污染進展，pH 可能略微上升。

大家在培養瓶裡描述的「絲狀」或「棉絮狀」外觀，幾乎都是絲狀真菌。

常見來源。 空氣中的孢子 —— 真菌孢子耐受性強、無所不在，可在表面存活很長時間。建築工程、潮濕、保養不良的培養箱（水盤是典型的孢子庫），以及受污染的培養箱層架。把紙箱包裝帶進細胞培養室是一個被低估的來源。

處理方式。 丟棄，而且要把它當成「培養箱層級」的事件處理，而不是單一培養瓶的事件。清空培養箱，取出層架與水盤並高壓滅菌，執行培養箱的除污程序或以核可的殺孢子劑擦拭，並在水盤中換上含核可抗真菌水處理劑的新鮮無菌水。已在培養箱定殖的真菌孢子，會不斷重新感染新的培養物，直到培養箱本身被徹底清潔為止。

外觀。 沒有。這正是整個問題所在。黴漿菌可以達到每 mL 10⁷–10⁸ 個菌體而不產生混濁、沒有可見的 pH 變化，在例行的倒立顯微鏡下也看不到任何東西。菌體大小 0.3–0.8 µm、沒有細胞壁，可以穿過 0.2 µm 濾膜，而且本質上對青黴素具抗性。

間接徵兆都是非特異性的，而且很容易被合理化帶過：生長逐漸變慢、飽和密度下降、培養基消耗得比預期快、轉染效率下滑、藥物反應出現漂移。出現其中任何一項，該做的是檢測，而不是換一批血清。

常見來源。 同一間實驗室裡其他已受污染的培養物，透過氣溶膠與共用瓶罐擴散；實驗人員本身，因為好幾種污染菌種都是人類口腔共生菌；動物來源的血清與胰蛋白酶，在歷史上曾是重要途徑，如今已大幅減少；以及來自非細胞庫來源的外來細胞株。

處理方式。 以第二種方法確認、隔離，通常直接丟棄 —— 從乾淨的凍存細胞重新開始，比治療更快、也更站得住腳。完整的檢測方法比較、檢測頻率，以及「清除或丟棄」的決策，請見黴漿菌檢測專文。

外觀。 在帶原的培養物中通常看不出來。許多病毒可以在宿主細胞株中複製而不產生細胞病變效應，培養物的外觀與生長都很正常。若真的出現細胞病變效應，會表現為細胞變圓、脫落、合胞體形成，或單層細胞中出現類似噬斑的空洞區，這些都很容易被誤認為過度匯合或一次失敗的胰蛋白酶消化。

為什麼重要。 對例行研究用的培養物來說，病毒污染很少構成問題；但對任何要用於生物製劑或細胞治療製造的材料而言，它是嚴重的問題，而且當來源材料為人類或靈長類時，它也是實驗室生物安全上的考量。

常見來源。 原始組織或捐贈者材料；動物來源的原料，主要是血清與胰蛋白酶；以及設施內的其他培養物。

處理方式。 病毒檢測屬於專業工作 —— 針對特定病原的 PCR 套組，以及在指示細胞株上進行的體外外源因子試驗以做廣泛篩檢。對例行研究而言，預防才是實際可行的控制手段：使用會公開病毒篩檢資料的血清與胰蛋白酶供應商，或改用無動物來源成分（ADCF）試劑與重組解離酵素，直接把這條途徑移除。

細胞生物學中後果最嚴重的污染，根本不是微生物：而是一株細胞蓋過另一株，或是在流傳過程中的某個環節被貼錯標籤。

大規模的身分鑑定調查一再發現，實驗室中使用中的細胞株，有相當比例並不是標籤上寫的那一株。HeLa 是最有名的元兇 —— 生長快、韌性強，在歷史上取代了許多其他細胞株 —— 但任何生長旺盛的細胞株，只要曾經與較慢的細胞株混在一起，都會把對方蓋過去。

外觀。 沒有；或者只是形態、生長速率或標記表現上的緩慢漂移，而這些都很容易被歸因於繼代次數。

來源。 同時在操作櫃內處理兩株細胞。共用培養基瓶。標籤錯誤的凍存管。冷凍櫃紀錄不良。從流傳紀錄不明的合作者手中拿到細胞株。

處理與預防。 短串聯重複序列（STR）圖譜分析是人類細胞株的標準身分鑑定方法，鼠源細胞株也有對應的 STR 套組。收到細胞株時、建立細胞庫時，以及之後定期，都應該做一次圖譜比對。絕對不要同時在操作櫃內開啟兩株細胞。絕對不要在不同細胞株之間共用同一瓶培養基。目前多數期刊都要求提供 STR 驗證的身分聲明，而一次圖譜分析的成本，相對於一次實驗必須重做的代價，小到可以忽略。

不是所有看起來不對勁的東西都是活的。在丟棄培養物之前，先排除非生物性的解釋：

• 內毒素來自水、血清或原料，會活化具免疫能力的細胞、改變生長與分化，卻不留下任何可見跡象。它耐熱、撐得過高壓滅菌，而且無法用 0.2 µm 過濾去除。
• 清潔劑或消毒劑殘留留在玻璃器皿上，或來自沖洗不完全的操作櫃檯面。
• 塑化劑或可萃取物溶出，來自管線、儲存瓶或非細胞培養級的塑膠。
• 沉澱物 —— 磷酸鈣結晶、析出的血清蛋白，或低溫保存後結晶的培養基成分 —— 在顯微鏡下看起來像顆粒狀污染，但它們具折光性、形狀規則，不會自己移動，也不會在兩次觀察之間增殖。四小時後再看一次：污染會長大，沉澱不會。
• 細胞碎片與凋亡小體來自受壓迫或過度匯合的培養物，在低倍率下可能很像細菌污染。把倍率調高通常就能分辨。

以下大致按照「每投入一分力氣能擋掉多少污染」排序：

1. 無菌操作技術與操作櫃紀律。 在正確的玻璃門高度作業，讓手與物品位於關鍵開口的下游，絕對不把任何東西從開口容器上方越過，每一件進入操作櫃的物品都用 70% 酒精擦拭，不要對著櫃內說話。光是這一項就能擋掉大部分污染。
2. 一次只開一株細胞，一株細胞一瓶培養基。 一舉消除交叉污染，以及大部分微生物的水平傳播。
3. 新進培養物先隔離，放在獨立的培養箱中直到檢測完成。
4. 維護培養箱。 每週更換水盤並加入核可的水處理劑、每月擦拭、按排程執行除污程序，並依原廠建議的週期更換 HEPA 濾網。
5. 每年驗證操作櫃，並確認氣流警報功能正常。
6. 及早建庫、乾淨建庫，並檢測細胞庫。 一個低繼代數、已完成檢測的主細胞庫，可以把一次污染事件降級成一個下午的麻煩。
7. 不要用預防性抗生素取代以上任何一項。 它們會遮蔽低量的細菌污染，對黴漿菌、真菌或交叉污染完全無效，還會讓實驗室不再察覺自己的操作技術已經走樣。