細胞培養基中的酚紅

酚紅的化學名稱是酚磺酞，屬於磺酞類染料，以游離酸計算分子量為 354.4，培養基配方中所用的鈉鹽則為 376.4。大多數古典細胞培養基都加了它，理由只有一個：它是一種 pH 指示劑，而它的變色區間恰好橫跨哺乳動物細胞培養所處的 pH 範圍。

有幾件事值得先說清楚。酚紅不是緩衝劑。培養基中 5-15 mg/L 的含量約相當於 13-40 微莫耳濃度，對上碳酸氫鈉的 24-44 毫莫耳濃度——差了三個數量級。它對培養基 pH 穩定性的貢獻小到量不出來。它是讀數，不是控制手段。

它同樣不是養分、不是添加物，細胞也不需要它。每一種古典培養基都有無酚紅的版本，細胞在那些版本中的生長情形，與有顏色的版本完全相同。這個染料存在的唯一目的，是讓走過培養箱前的研究人員不必打開任何東西，一秒之內就看出某個培養是不是正往錯的方向走。

各家配方的濃度並未統一，這也是為什麼同一種橙色在不同培養基裡代表的意義略有差別，以及為什麼 RPMI 的顏色看起來從來就跟 DMEM 不一樣。

異數是 Ham's F-12，只有 1.2 mg/L，這正是 F-12 看起來比 DMEM 蒼白、褪色的原因，也是 1:1 混合的 DMEM/F-12 剛好落在中間、為 8.1 mg/L 的緣故。若要用顏色比較培養瓶，就只能比較裝著同一種培養基的瓶子。

有些平衡鹽溶液含酚紅，有些不含。HBSS 兩種形式都有販售；PBS 與 DPBS 通常不含酚紅。

酚紅在 pH 6.8 到 8.2 之間由黃逐漸轉紅，文獻報告的 pKa 約在 7.7 到 8.0 之間。酸式在 443 nm 附近有最大吸收，鹼式則在 570 nm 附近，這就是同一個染料呈現兩種截然不同外觀的原因。

真正重要的習慣是拿參考品來對照。把培養瓶放在白色背景前，旁邊擺一瓶同溫度、同配方的新鮮培養基。單獨看顏色下判斷、跨兩種培養基比較，或對著有顏色的檯面看，都不可靠。下方的對照表列出實用的判讀方式。

在依顏色採取行動之前還有一個提醒：它是半定量的，而且會落後。培養在肉眼看出變化之前，可能早已處於代謝壓力；而你最後看到的色偏，反映的是數小時累積下來的酸負荷，不是細胞此刻的狀態。把顏色當成「該去顯微鏡下看看」的提示，而不是單獨成立的診斷。

黃色代表酸，而在細胞培養裡，酸幾乎都來自乳酸。培養中的細胞以很高的速率進行有氧糖解，把乳酸排入培養基；隨之而來的質子把碳酸氫鹽緩衝系統滴定下去，一旦 pH 降到約 6.8 以下，指示劑就完全轉為黃色形式。

常見原因，大致依發生頻率排列：

培養單純太密。 已匯合或過度匯合的單層，或接近高峰密度的懸浮培養，一天之內就能產生足夠的乳酸把培養基變黃。這是正常的生理現象，處理方式是換液或繼代培養。如果某一瓶總是趕在下一次預定換液前變黃，就少接種一些細胞，或提高換液頻率。

培養被放太久。 週末餓上一整輪是經典案例。葡萄糖下降、乳酸累積，培養泡在酸裡夠久之後，就算補上新鮮培養基，存活率仍然會掉。

細菌汙染。 細菌讓培養基變酸的速度遠快於哺乳動物細胞，而且通常同時讓它變混濁。典型徵象是昨天還好好的培養基，今天又鮮黃又混濁，高倍下常常還看得到會動的顆粒。丟棄，不要試圖挽救，並檢查同一次操作中經手過的其他東西。

CO2 太高，或培養基與培養箱不匹配。 為 5% CO2 設計的培養基放在 10% 的環境裡，從一開始就會偏酸。碳酸氫鹽必須與氣體環境相配：碳酸氫鈉低於約 1.5 g/L 的培養基適合大氣或 4% CO2，1.5-2.2 g/L 適合 5%，高於 3.5 g/L 則適合 10%。DMEM 的 3.7 g/L 是為 10% CO2 設計的，放在 5% 培養箱中相對於設計點會略偏酸——多數實驗室接受這一點，也不會出什麼問題，但當一瓶培養基從第一天就看起來偏橙時，知道這件事是有用的。

粉紅或桃紅代表鹼性，而在碳酸氫鹽緩衝的培養基中，鹼性幾乎都表示 CO2 已經離開了系統。碳酸氫鹽還在，與它平衡的碳酸卻已化為氣體逸失，pH 因而往上爬。

培養基被拿出培養箱。 這是最常見的假警報。培養瓶一拿到操作檯上就開始流失 CO2，幾分鐘內就看得出泛紅。這跟培養本身毫無關係。判斷顏色時要用剛從培養箱拿出來的瓶子，否則就得接受：任何在檯面上拍到的照片都會看起來比實際更鹼。

培養箱沒有在供應 CO2。 鋼瓶用完、閥門關著、調節器故障或感測器漂移，都會讓培養箱裡的每一瓶同時變粉紅。如果所有培養一起變粉紅，先懷疑培養箱而不是細胞——並且用獨立的量測儀確認 CO2 濃度，因為校正跑掉的感測器會一邊顯示設定值、一邊什麼都沒供應。

箱門一直開著，或培養箱塞太滿。 頻繁或長時間開門會讓設定值來不及回復。靠近前緣的培養瓶最先變粉紅。

瓶蓋沒鎖對，或用錯了容器。 通氣瓶蓋是設計來與培養箱氣體環境平衡的。在 CO2 培養箱裡把碳酸氫鹽培養基鎖上密封蓋，就無法平衡；而在檯面培養時用通氣蓋，則會讓 CO2 跑掉。瓶蓋要配合培養所在的環境。

碳酸氫鹽對該氣體環境而言太高。 這是偏酸情況的鏡像：2.2 g/L 碳酸氫鹽的 Earle's 鹽類配方，或 3.7 g/L 的 DMEM，放在大氣中會很快轉鹼。設計來在空氣中維持 pH 的，是 0.35 g/L 的 Hanks' 鹽類配方。

有些汙染源會讓培養基變鹼。 少數汙染微生物是提高 pH 而非降低 pH。粉紅加上混濁，在證明不是之前仍然要當成汙染處理。

有兩種失效模式重要到必須說白。

黴漿菌通常不會造成顏色改變，也不會讓培養基混濁。 遭黴漿菌感染的培養往往看起來完全正常——培養基清澈、顏色如常、細胞照樣生長——但這個微生物已經改變了代謝、基因表現與實驗結果。用顏色來篩檢黴漿菌毫無用處。唯一可靠的做法，是依固定週期以 PCR 或專用的檢測方法例行送驗。

顏色正常不代表培養基的養分還完整。 葡萄糖可能已大幅耗盡，麩醯胺酸可能已分解為氨，而指示劑幾乎不動。酚紅報告的是質子的收支，不報告別的。看起來顏色沒問題的培養，仍然可能正在挨餓。

還有一個實務上的界線值得記住：酚紅無法區分一瓶健康而濃密的培養和一瓶被汙染的培養，兩者都會把培養基變黃。告訴你是哪一種的是顯微鏡，不是顏色。

酚紅會干擾光學量測，這也是把它拿掉的主要理由。

吸光度分析。 這個染料在 443 nm 與 570 nm 附近有強烈吸收。後面那個吸收峰正好壓在好幾種標準比色分析的判讀波長上——MTT 通常在 570 nm 判讀，Griess 亞硝酸鹽分析約在 540 nm——因此殘留的酚紅會墊高空白值、壓縮動態範圍。即使分析本身有做培養基空白，帶顏色的背景仍然會犧牲靈敏度；而且由於這個染料的吸光度本身隨 pH 改變，背景會跟著每個孔的代謝狀態一起移動。最後這一點正是悄悄毀掉整盤實驗的原因：忙碌的孔和安靜的孔，背景並不相同。

螢光量測。 酚紅在綠色到橙色範圍貢獻寬廣的背景，並可能透過內濾效應淬熄訊號。活細胞影像、螢光微盤分析，以及細胞仍帶著培養基的流式細胞分析，都會因為改用無酚紅配方而受益。做影像時常見的選擇是無酚紅培養基搭配 HEPES，因為它同時能在顯微鏡載台這種沒有 CO2 環境的地方維持 pH。

雌激素反應性細胞的實驗。 留到下一節討論。

生物製劑生產與下游製程。 當某個培養基成分必須從產品中清除時，多餘的染料就是多餘的清除負擔，因此生產用培養基普遍採用無酚紅配方。

部分質譜與代謝體學流程， 因為這個染料及其雜質會以干擾離子的形式出現。

這件事值得精確陳述，因為它被以走樣的形式廣泛流傳。

Berthois、Katzenellenbogen 與 Katzenellenbogen 在 1986 年報告，酚紅製劑在 15-45 微莫耳濃度下具有可測得的雌激素活性，而那正好就是這個染料在培養基中的存在範圍。他們發現它會與人類乳癌細胞株 MCF-7 的雌激素受體結合，親和力約為雌二醇的 0.001%（Kd 約 2 x 10^-5 M），並在雌激素受體陽性的 MCF-7 細胞中造成劑量依賴性的增生刺激，而在受體陰性的 MDA-MB-231 細胞中則沒有。

兩年後，Bindal 等人以 HPLC 與溶劑分配證明，這種受體結合與促生長活性並不屬於酚磺酞本身，而是來自市售製劑中脂溶性較高的雜質——其中一個被鑑定為雙(4-羥基苯基)[2-(苯氧磺醯基)苯基]甲烷——而且許多市售製劑中都存在足以造成干擾的量。相關研究也把陽離子運輸方面的效應歸因於一種脂溶性雜質。

無論責任落在哪個分子，實務上的結論都一樣：如果你研究的是雌激素反應，或任何位於雌激素受體訊息傳遞下游的事情，就使用無酚紅培養基。標準組合是無酚紅培養基搭配活性碳處理血清，這樣同時去掉了染料帶來的活性與血清貢獻的類固醇。某一批酚紅的純度不是你在實驗檯上能驗證的事，所以把這個變數移除，比假設自己拿到乾淨的批次可靠得多。

對於沒有雌激素受體、也不關心那條路徑的細胞來說，這並不構成換培養基的理由。

改用無酚紅配方，代價是失去那個免費、連續、一眼可見的 pH 訊號，而換過去的實驗室往往低估了自己原本有多依賴它。被汙染的培養瓶會比較晚被發現，耗盡的培養基更晚。

有三項補償措施值得建立。第一，依據該細胞株在該接種密度下的生長曲線把換液排程固定下來，不要憑眼睛換液。第二，在關鍵時刻直接量 pH——用校正過的 pH 計量一份廢培養基，一分鐘就好。第三，若要進行長期的無酚紅實驗，就在同一排程下另外養一瓶有顏色的同株細胞當對照，好讓你對「沒有顏色的那幾瓶何時需要照顧」有個視覺參考。

加入 10-25 mM 的 HEPES 是無酚紅工作常見的搭配改動，因為它能在影像拍攝或較長時間的操作中，於培養箱之外維持 pH。HEPES 並不能取代指示劑——它處理的是穩定性，不是可見性——而且它自己也有需要考量的地方，包括光照下的光毒性。

最後釐清一個容易混淆的地方：酚紅在微生物學中也作為醣類發酵培養液的指示劑，那是另一個領域的另一種應用。本頁討論的是酚紅作為哺乳動物細胞培養基 pH 指示劑的用途。