細胞株に適したDMEMの選び方
DMEM の選択が誤っていると、HEK293T トランスフェクション試験は24時間時点では正常に見えても、72時間時点で収量を逃すことがあります。通常の分岐は高グルコース 4.5 g/L と低グルコース 1.0 g/L ですが、フェノールレッド、ピルビン酸、HEPES、glutamine 化学も同じくらい重要なことがよくあります。このガイドは実用的な選択ルールから始め、その後 pH 7.21、浸透圧 312 mOsmol/kg、96時間時点の HEK293T 生存率 96.3% など、測定された品質管理確認を示します。
問題点（具体例を含む）
よくある事例：HEK293T (ATCC CRL-3216) は日常継代中、高グルコース DMEM でよく増殖していたものの、ピルビン酸ナトリウムを静かに除去し、安定型 glutamine から遊離 L-glutamine に切り替えた試薬変更後に、生存率が92%から78%へ低下しました。
これは不可解な細胞株の不具合ではありません。処方の不一致です。
DMEM の選択は通常、グルコース濃度、フェノールレッド、L-glutamine 形態、ピルビン酸ナトリウム、HEPES、アミノ酸セットという6つの次元で決まります。高グルコース 4.5 g/L は、速い解糖系の細胞株と高密度培養を支えます。低グルコース 1.0 g/L は、細胞が乳酸蓄積、形態変化、または代謝感受性の読み取りを示す場合、多くの場合より良い出発点です。
- グルコース: HEK293T (ATCC CRL-3216)、U-2 OS (ATCC HTB-96)、および多くの高密度ワークフローには 4.5 g/L。より遅い初代様または代謝感受性研究には 1.0 g/L。
- フェノールレッド: 日常培養および目視での pH ドリフト確認には維持します。蛍光イメージング、ホルモン感受性アッセイ、または弱いレポーター読み取りでは除去します。
- L-glutamine: 遊離 L-glutamine が従来型ですが、安定型 glutamine ジペプチドは長時間フィード中のアンモニア上昇を低減します。
- ピルビン酸ナトリウム: 1.0 mM で酸化ストレス緩衝と回復に有用です。ピルビン酸が代謝フラックスアッセイに影響する場合は除外します。
- HEPES: 低 CO2 取り扱い、顕微鏡観察、5% CO2 インキュベーター外での輸送時間には 10 から 25 mM で有用です。
- アミノ酸セット: 標準 DMEM は日常維持に適し、ATCC 改変は従来の細胞バンクプロトコルとの一致に役立ち、高度なアミノ酸セットは高密度またはストレスを受けやすい培養を支えます。
メカニズム（図1、図2）
図1、グルコースと乳酸の負荷。 高グルコース DMEM はグルコース 4.5 g/L から始まり、増殖の速い細胞により多くの炭素源予備量を与えます。その代償は乳酸の生成です。高密度の HEK293T (ATCC CRL-3216) または HeLa (ATCC CCL-2) 培養では、乳酸が 20～25 mM を超えると、増殖の低下、pH の 7.0 未満へのずれ、培地の早期枯渇を伴うことがよくあります。
図2、緩衝液と窒素化学。 重炭酸緩衝 DMEM は CO2 制御を前提に設計されています。HEPES は、ディッシュが室内空気中に 30～90 分置かれる可能性があるベンチ上での取り扱いや生細胞イメージング中に、緩衝能を追加します。グルタミン化学が重要なのは、遊離 L-グルタミンが保存中および培養中に分解する一方、安定型グルタミンは 72～120 時間の運転でアンモニア負荷を低減できるためです。
ピルビン酸は別の判断点にあります。酸化ストレスからの回復を支え、細胞に追加の炭素源を与えることができますが、ミトコンドリア表現型を覆い隠すこともあります。Seahorse 型の代謝アッセイ、乳酸トレーシング、またはピルビン酸応答研究では、ピルビン酸不含 DMEM から開始し、ピルビン酸を制御された変数として追加してください。
基礎培地の論理は古いものですが、今でも有用です。Eagle による定義栄養素の研究は、アミノ酸、ビタミン、塩類、グルコースを背景成分ではなく能動的な実験変数として扱うべき理由を確立しました [1] イーグル H. サイエンス 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.
測定方法
名称だけで DMEM を選ばないでください。測定されたロット値を確認し、それを細胞株とアッセイに適合させてください。
| 測定項目 | 代表的な出荷判定値 | 許容範囲 | 重要な理由 |
|---|---|---|---|
| 20～25°C での pH | 7.21 | 7.0～7.4 | 培養開始前に CO2 と緩衝液の不一致を示します |
| 浸透圧 | 312 mOsmol/kg | 260～320 mOsmol/kg | 高い値は MDCK (ATCC CCL-34) および MRC-5 (ATCC CCL-171) にストレスを与えます |
| エンドトキシン、LAL | ≤0.25 EU/mL | ≤0.50 EU/mL | 炎症および上皮系の読み出しに重要です |
| マイコプラズマ、定量PCR | 検出されず | 検出されず | 増殖速度およびトランスクリプトームデータを保護します |
| 無菌性 | 米国薬局方 <71> 合格 | 増殖なし | 日常培養へのリリースに必要です |
| 増殖促進 | HEK293T、96 時間で生存率 96.3% | 生存率 ≥90.0% | 処方が感受性の高い高速増殖株を支持することを確認します |
グルコースの選択では、48 時間後と 72 時間後に使用済み培地を測定してください。グルコースが 1.5 g/L を超えて残っている一方で乳酸が 22 mM を超える場合、さらに高い栄養密度へ変更することが答えになることはまれです。生存率が 90% を超えたままグルコースが 0.5 g/L 未満に低下する場合は、高グルコースまたはフィード戦略の方がより妥当です。
細胞タイプ別の許容閾値（表）
| 細胞株 | 代表的な DMEM 開始点 | グルコースの推奨 | ピルビン酸 | フェノールレッド | HEPES に関する注記 |
|---|---|---|---|---|---|
| HEK293T (ATCC CRL-3216) | L-グルタミン含有高グルコース DMEM | 4.5 g/L | 任意、回復用に 1.0 mM が多い | 通常継代では含有、イメージングでは不含 | トランスフェクション処理でプレートが CO2 から出る場合は 10～25 mM |
| HeLa (ATCC CCL-2) | 高グルコース DMEM、標準アミノ酸 | 4.5 g/L | 通常は許容される | 蛍光またはエストロゲン感受性の作業では除去 | 30 分を超える顕微鏡観察セッション中に有用 |
| MRC-5 (ATCC CCL-171) | 低グルコース DMEM または適合する従来改変 | 1.0 g/L | 老化マーカーをモニターする場合は慎重に使用 | 通常の線維芽細胞培養では含有 | 低 CO2 での取り扱いが必要でない限り、過剰な緩衝液を避ける |
| Vero (ATCC CCL-81) | 拡大培養用の高グルコース DMEM | 4.5 g/L | 融解後の回復中に役立つことが多い | イメージングのエンドポイントで色素不含が必要な場合を除き含有 | インキュベーター外での輸送および感染設定に適する |
| MDCK (ATCC CCL-34) | 低～中程度グルコース DMEM、厳密な浸透圧管理 | まず 1.0 g/L、その後最適化 | アッセイ依存 | バリア機能イメージングでは除去 | 開放プレート作業が 45 分を超える場合に使用 |
| HepG2 (ATCC HB-8065) | ピルビン酸含有高グルコース DMEM | 4.5 g/L | 一般に 1.0 mM | 代謝蛍光アッセイでは不含 | 肝細胞系アッセイでは長時間の取り扱いを伴うことが多いため有用 |
| U-2 OS (ATCC HTB-96) | 高グルコース DMEM、イメージンググレードの選択肢 | 4.5 g/L | 任意 | 生細胞蛍光では不含 | 5% CO2 外でのタイムラプスイメージングに推奨 |
| NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) | 日常的な拡大培養用の高グルコース DMEM | 4.5 g/L | 通常は許容される | 維持培養では含有 | 取り扱い条件で必要な場合にのみ使用 |
これらは開始点であり、恒久的な規則ではありません。新しい処方で少なくとも 2 継代した後、形態、倍加時間、使用済みグルコース、乳酸、生存率を再確認してください。
緩和方法
培養は増殖しているのにアッセイが不安定な場合は、一度に 1 つの DMEM 変数だけを変更してください。高グルコース、フェノールレッド含有、遊離 L-グルタミン含有、ピルビン酸含有の処方から、色素不含、HEPES 緩衝、ピルビン酸不含の培地へ完全に切り替えると、同時に 4 つの交絡因子を生じさせる可能性があります。
- ピルビン酸に感受性のある細胞： ピルビン酸不含 DMEM を注文し、比較群にのみピルビン酸ナトリウムを 0.5 または 1.0 mM で添加してください。
- 色素不含イメージング用途： フェノールレッド不含 DMEM を選び、実際に使用するフィルターセットでバックグラウンドを確認してください。弱い緑色レポーターでは、これはグルコースの選択より重要になることがあります。
- 低 CO2 インキュベーションまたは開放取り扱い： 10～25 mM HEPES を使用してください。インキュベーター外で 60 分後の pH を確認し、目標を 7.1～7.4 としてください。
- より長い培養期間： 運転が 72 時間を超える場合、またはアンモニア感受性の生存率低下が現れる場合は、安定型グルタミンを使用してください。
- 従来プロトコル： サプリメントを調整する前に、ATCC 改変または標準アミノ酸セットに合わせてください。
低グルコース DMEM から高グルコース DMEM に切り替える場合は、2 継代の馴化を実施してください。MRC-5 (ATCC CCL-171) では、急激な浸透圧および栄養の変化により、生存率が変化する前に形態が変わることがあります。
実例
ある研究室が、HEK293T (ATCC CRL-3216) の一過性トランスフェクションと U-2 OS (ATCC HTB-96) の生細胞イメージングに、1 種類の DMEM を使いたいと考えています。最初の直感は、増殖を支えるために、フェノールレッド、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムを含む高グルコース DMEM を選ぶことです。しかし、それはイメージングには理想的ではありません。
選択を 2 種類の培地に分けてください。HEK293T の拡大培養とトランスフェクションでは、高グルコース DMEM、グルコース 4.5 g/L、安定型グルタミン、フェノールレッド含有、ピルビン酸 1.0 mM から開始します。出荷判定検査では、pH 約 7.2、浸透圧約 300～315 mOsmol/kg、エンドトキシン ≤0.25 EU/mL、定量PCR によるマイコプラズマ検出なしが示されるべきです。
U-2 OS のイメージングでは、フェノールレッド不含の高グルコース DMEM を選び、プレートが 5% CO2 外に置かれる場合は 10～25 mM HEPES を添加し、生物学的に必要でない限りピルビン酸は省略してください。適格性確認ランでは、48 時間のコンフルエンス、形態、蛍光バックグラウンドを比較します。少なくとも 90% の生存率を維持し、レポーターチャネルでより低いバックグラウンドを示す培地を維持してください。
スケールアップまたは高密度培養では、使用済み培地の測定の方がカタログ上の名称より予測性が高くなります。CHO およびハイブリドーマ工程の文献は、グルコース、グルタミン、乳酸、アンモニアを個別のチェック項目として選ぶのではなく、まとめてバランスさせる必要があることを繰り返し示しています [2] オズターク SS ほか. バイオテクノロジー・プログレス 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.
参考文献（番号付き、DOI付き）
- イーグル H. 組織培養における哺乳動物細胞株の特定アミノ酸要求性。サイエンス 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
- オズターク SS、パルソン BO. ハイブリドーマ細胞培養における増殖、代謝、抗体産生の速度論：バッチリアクターにおける血清濃度、溶存酸素濃度、培地 pH の影響。バイオテクノロジー・プログレス 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
- アルタミラノ C、パレデス C、カイロ JJ、ゴディア F. CHO 細胞培養培地処方の改善：グルコースとグルタミンの同時置換。バイオテクノロジー・プログレス 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
- チェン G、グルブランソン DR、ホウ Z、ボリン JM、ルオッティ V、プロバスコ MD ほか. ヒト iPSC の樹立および培養のための化学的に定義された条件。ステムセル・リポーツ 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001