DMEM — ダルベッコ改変イーグル培地

DMEM は 1959 年に Renato Dulbecco と Gordon Freeman が、ポリオーマウイルスのプラークアッセイのために Harry Eagle の培地を改変したものとして報告しました。変更点は意図的に単純で、Eagle の処方をそのまま用い「アミノ酸とビタミンを4倍濃度にする」というものです。同じ年に発表された Eagle 自身の最小必須培地（MEM）は、哺乳類細胞が培養下で必要とする最小限の栄養素 — 13 種の必須アミノ酸、8 種のビタミン、グルコース、そして Earle's 平衡塩溶液の 6 種の無機塩 — をすでに確立していました。

濃度を上げたことには意味がありました。Eagle の MEM はそもそも最小限であるように設計されていたためです。培養液はすぐに枯渇し、頻繁な培地交換が必要でした。アミノ酸とビタミンを4倍にすることで、交換の合間により高い細胞密度を支えられる培地になります。これは数日かけてプラークを数えるウイルス学者が求めていたものそのものです。

現在市販されている DMEM は、すべての成分が文字どおり MEM の4倍というわけではありません。供給元はグリシン、セリン、硝酸鉄(III) を加え、塩バランスも変更しました。炭酸水素ナトリウムは 2,200 から 3,700 mg/L へ引き上げられ、浸透圧を補正するために塩化ナトリウムは 6,800 から 6,400 mg/L へ下げられています。今日「DMEM」として販売されている培地は安定した十分に特性評価された標準品ですが、それは 1959 年のレシピそのものではなく、あくまで商用の標準処方です。

細胞培養でもっとも使われている2つの基礎培地であり、どちらを使うかという問いは絶えず出てきます。両者は互換ではなく、違いは見かけではなく構造的なものです。

判断はたいてい3つの問いに落ち着きます。

その培養は接着性か、浮遊性か。 DMEM の 1.8 mM のカルシウムはしっかりした接着を支えます。RPMI の 0.42 mM は、リンパ芽球様の細胞が浮遊したままでいられるよう意図的に低く保たれています。接着性の線維芽細胞株や上皮細胞株は DMEM へ、浮遊のリンパ系・造血系細胞は RPMI へ入れます。

その株の標準プロトコルは何と言っているか。 確立した株では、これは好みの問題ではありません。株を DMEM と RPMI のあいだで切り替えると、倍加時間、飽和密度、しばしばタンパク質発現までが変わります。あとで株を再評価しない限り、公表された文献との比較が成り立たなくなります。

その培養は代謝的にどれだけ要求が高いか。 25 mM のグルコースと、RPMI のおよそ4倍のアミノ酸濃度を持つ DMEM は、密で速く要求の高い培養のために作られています。RPMI は数日かけて中程度の速度で増える細胞のためのもので、密な培養では早く枯渇します。

どちらかが単純に栄養豊富というわけではありません。DMEM はアミノ酸とグルコースで勝り、RPMI はビタミン、リン酸による緩衝、そして珍しい還元型グルタチオンの含有で勝ります。

以下は標準的な高グルコース DMEM の処方です（主要な供給元で共通して使われる参照処方で、Gibco 11965 や Sigma D5796 系の製品に相当します）。低グルコース DMEM は、D-glucose が 4,500 mg/L ではなく 1,000 mg/L である点を除き同一です。

無機塩と主要成分

アミノ酸（mg/L）

グリシン 30；L-アルギニン·HCl 84；L-シスチン·2HCl 63；L-ヒスチジン·HCl·H2O 42；L-イソロイシン 105；L-ロイシン 105；L-リジン·HCl 146；L-メチオニン 30；L-フェニルアラニン 66；L-セリン 42；L-トレオニン 95；L-トリプトファン 16；L-チロシン二ナトリウム塩二水和物 104；L-バリン 94。

ビタミン（mg/L）

塩化コリン 4；D-パントテン酸カルシウム 4；葉酸 4；ニコチンアミド 4；ピリドキシン·HCl 4；チアミン·HCl 4；i-イノシトール 7.2；リボフラビン 0.4。

含まれていないものに注目してください。DMEM には、グリシンとセリン以外の非必須アミノ酸は入っていません — アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリンはいずれも不在です。ヌクレオシド、ビオチン、ビタミン B12、リポ酸も含みません。微量金属は名目的な量の硝酸鉄(III) だけです。細胞が必要とするそれ以外のものは、すべて血清から供給される前提になっています。これが DMEM のもっとも重要な構造上の事実です。脂質、微量元素、キャリアタンパク質、増殖因子は血清が供給するという前提の上に組み立てられた、アミノ酸とビタミンの豊富なベースなのです。

2つのグルコース濃度は互換の既定値ではありません。習慣で選ぶことが、再現しないデータのよくある原因になっています。

高グルコース（4,500 mg/L、25 mM） は、生理的な血糖値のおよそ5倍にあたります。増殖の速い形質転換株、HEK293 での一過性トランスフェクションとウイルス産生、ハイブリドーマ、そして頻繁な培地交換なしに高密度まで持っていきたい培養に使います。余分なグルコースは栄養の貯蔵庫として働きます。その代償として、25 mM のグルコース下で育った細胞は解糖系に強く依存し、乳酸の蓄積で培地をより速く酸性化させ、研究対象の生物学ではなく培地に由来する解糖系優位の表現型を示すことがあります。

低グルコース（1,000 mg/L、5.6 mM） は、ヒトの正常な血糖値に近い濃度です。初代肝細胞、高グルコースが分化に影響することが報告されている間葉系間質細胞、長期培養や分化培養、そして解糖系を全開にしたくない代謝研究に使います。酸化的代謝と解糖系を比較する場合も、低グルコース DMEM のほうが適切です。多くの形質転換株では、25 mM のグルコースが Crabtree 効果を介して酸化的リン酸化を抑制するためです。

グルコース不含 DMEM も同じ理由で存在します。炭素源を自分で決められるので、ガラクトースに置き換えて酸化的代謝を強制したり（ミトコンドリア毒性スクリーニングの標準的な手法です）、グルコースを任意の濃度に調整したりできます。

確立した培養をグルコース濃度の違う培地へ切り替えるときは、段階的に行い、増殖曲線を取り直してください。倍加時間、継代時のコンフルエンシー、トランスフェクション効率のいずれもずれます。

DMEM の発注で混乱が起きるのは、供給元が自由に組み合わせる4つの独立したオプションがあるためです。

グルタミン。 L-glutamine 4 mM が標準ですが、溶液中では分解します。環化してピロリドンカルボン酸となりアンモニアを放出し、半減期は 4 °C で数週間、37 °C ではさらに短くなります。グルタミン不含の DMEM を選べば、使用時に新しいグルタミンを加えられますし、溶液中で安定でありながら細胞が切断することで徐々にグルタミンを放出するジペプチド型（L-alanyl-L-glutamine）に置き換えることもできます。全量交換なしに1週間を超えて培養するものであれば、ジペプチドのほうが設計として優れています。

ピルビン酸ナトリウム。 1 mM で、追加のエネルギー基質とわずかな抗酸化作用をもたらします。低密度あるいは低血清の細胞では播種効率を助けるため、実際に有用です。代謝フラックスの実験では外してください。標識されていないピルビン酸プールがトレーサーの解釈を複雑にします。

フェノールレッド。 15 mg/L の pH 指示薬であり、栄養素ではありません。測定に干渉する場合 — 550–600 nm 付近の蛍光・吸光アッセイ、フローサイトメトリー — は不含品を選んでください。またフェノールレッドには弱いエストロゲン様活性があり、MCF-7 のようなホルモン応答性の株では問題になります。

HEPES。 通常 10–25 mM で、インキュベーター外での操作中に pH を安定させるために加えます。HEPES は pH 7.2–7.4 付近で良く緩衝し、CO2 に依存しません。ただし代償は現実にあります。HEPES は光の下で過酸化水素を生じて光毒性を示し、25 mM では一部の初代細胞や幹細胞培養に細胞毒性を示します。実験台での作業時間が長いプロトコルのために使うものであって、既定の添加成分ではありません。

DMEM/F-12 は DMEM と Ham's F-12 の 1:1 混合物で、血清を減らす方向へ進もうとする人にとって DMEM ファミリーの中でもっとも有用なものです。

Ham's F-12 は 1965 年に Richard Ham が発表した、クローン増殖のための化学組成既知の培地であり、栄養学的には DMEM の正反対です。アミノ酸濃度は控えめですが、DMEM に欠けている成分を幅広く含みます — 微量元素（亜鉛、銅、硫酸鉄(II) としての鉄）、脂質前駆体（リノール酸、リポ酸、プトレシン）、ヌクレオシド前駆体（ヒポキサンチン、チミジン）、追加のビタミン（ビオチン、B12）です。両者を混ぜると、DMEM の栄養濃度と F-12 の幅を併せ持つベースになります。

標準的な DMEM/F-12 の処方には、グルコース 3,151 mg/L（17.5 mM）、炭酸水素ナトリウム 2,438 mg/L（29 mM）、塩化カルシウム 116.6 mg/L、ピルビン酸ナトリウム 55 mg/L（0.5 mM）、L-glutamine 365 mg/L（2.5 mM）、フェノールレッド 8.1 mg/L が含まれ、さらに F-12 由来の微量元素が F-12 の半分の濃度で入っています。広く使われている HEPES 型では HEPES 15 mM に置き換え、炭酸水素塩をおよそ 1,200 mg/L まで下げています。

DMEM/F-12 は、無血清・低血清処方、ケラチノサイトと上皮細胞の培養、神経幹細胞（N-2 または B-27 添加）、ハイブリドーマや iPSC の作業における標準のベースです。DMEM ベースの工程で血清を下げたい場合、ベースを DMEM/F-12 に移すのがたいてい最初の有効な一手になります。血清が静かに供給していた微量元素と脂質前駆体が、すでに培地に入っているからです。

DMEM の使用時の pH は 7.2 ± 0.2 です。 これはこの培地の標準規格であり、ほとんどの哺乳類細胞が培養される範囲でもあります。この数値は、想定された CO2 環境で平衡に達した完全培地について言うものであって、その条件でなければ数値に意味はありません。

DMEM は重炭酸緩衝系（炭酸水素塩と CO2）で緩衝されています。溶存 CO2 は炭酸となり、炭酸水素イオンとプロトンに解離します。pH は炭酸水素イオン濃度と CO2 分圧の比で決まります。つまり、培地の炭酸水素塩濃度とインキュベーターの CO2 濃度は必ず対になっているということです。

だからこそ、冷蔵庫から出したばかりのボトルの pH を測ってもほとんど何も分かりません。CO2 環境の外では培地は溶存 CO2 を失ってアルカリ側を示し、多くは 7.6 以上になります。そしてインキュベーターに戻せば1〜2時間で規格の範囲に戻ります。意味のある値が必要なら、キャップをゆるめた分注をまずインキュベーターで平衡化させるか、pH が CO2 にまったく依存しない HEPES 緩衝型の処方を使ってください。

DMEM の 3,700 mg/L（44 mM）という炭酸水素塩は、5% ではなく 10% CO2 のために設計されています。 これはこの培地についてもっとも見落とされている事実です。5% CO2 では炭酸水素塩が過剰になり、培地はアルカリ側に傾きます。インキュベーターに入れた直後は通常 pH 7.6–7.8 で、見た目にもピンクから紫がかった色になります。それでも多くの研究室は 5% CO2 で DMEM を使い、問題なく回しています。代謝する細胞が乳酸と CO2 を出し、数時間のうちに pH を引き戻すからです。しかし播種直後の低密度のフラスコにはその補正が働かず、播種効率が落ちます。5% CO2 で培養していて培地がいつまでも紫のままであれば、10% CO2 に移すか、炭酸水素塩を減らした処方を使うか、HEPES を加えてください。

逆に培地が黄色くなるのは、単純な酸性化です。フェノールレッドは pH 6.8 付近より低いと黄色になります。過増殖、高グルコースによる乳酸産生、CO2 の供給切れや漏れ、細菌のコンタミネーションはいずれも同じ結果を招きます。昨日播種したばかりで顕微鏡下ではまばらなのに培地が黄色いフラスコは、代謝ではなくコンタミネーションを疑ってください。

ボトルを大気圧下で開けているあいだ炭酸水素塩は CO2 として抜けていくため、実験台に置いた培地は徐々にアルカリ性になります。これは正常な現象で、インキュベーターに戻せば元に戻ります。ボトルを開けている時間を短くする理由にはなりますが、ボトルを捨てる理由にはなりません。

DMEM は、接着依存性の細胞に対する標準のベースです。HEK293 とその派生株、HeLa、NIH/3T3 をはじめとする線維芽細胞株、COS-7、Vero、MDCK、C2C12 筋芽細胞、初代線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞（通常は追加の添加成分とともに）、そして接着型 CHO が該当します。血清の添加は 10% ウシ胎児血清（FBS）が一般的で、丈夫な株には 5–10% の新生仔ウシ血清も使われます。

DMEM のカルシウム濃度の高さ（1.8 mM）は脚注ではなく、実際の選択基準です。この濃度のカルシウムはカドヘリンを介した細胞間接着を促し、ケラチノサイトの分化を進めます。そのため、ケラチノサイトや一部の上皮細胞のプロトコルでは低カルシウムのベースを指定します。逆に、しっかりした接着を必要とする細胞は、カルシウムがおよそ 0.4 mM しかない RPMI よりも DMEM のほうが良く育ちます。

一方、浮遊のリンパ系培養 — ヒトの白血病・リンパ腫株の多く、PBMC、低密度のハイブリドーマ — に対して、DMEM は第一選択として不向きです。これらには RPMI 1640 が確立したベースです。血清なしで極めて低い密度からクローン増殖させる用途にも向きません。それは Ham's F-12 と DMEM/F-12 が担う領域です。

血清。 10% FBS が標準です。非働化（熱処理済み、56 °C、30 分）は補体感受性の実験では慣例ですが、常に必要というわけではなく、一部の増殖因子を壊します。習慣ではなく意図して決めてください。

よく使う追加成分。 血清を減らした DMEM 培養では、非必須アミノ酸を 1x（100x ストックから）加える価値があります。DMEM 自身の非必須アミノ酸はグリシンとセリンに限られているためです。ピルビン酸ナトリウムは、まだ入っていなければ 1 mM を。ペニシリン/ストレプトマイシンは本当に必要な場合だけにしてください。抗生物質の常用は低レベルのコンタミネーションを覆い隠し、マイコプラズマのリスクの見え方を変えてしまいます。

保存。 液体の DMEM は 2–8 °C で遮光保存し、表示された有効期間（未開封で 12–24 か月が一般的）まで安定です。グルタミンを加えたら、その培地の実用寿命は 2–8 °C でおよそ4週間と考えてください。リボフラビン、葉酸、トリプトファン、HEPES はいずれも光に弱く、実験室の照明下に置いた培地は過酸化水素と分解物を生じ、播種効率を下げます。ボトルは開いた棚ではなく暗所に保管してください。

加温。 必要な分だけ温めてください。500 mL のボトルを繰り返し 37 °C まで上げると、グルタミンの分解と炭酸水素塩の損失が加速します。ほとんどの作業では室温まで戻せば十分で、細胞にかける前に 37 °C へ達している必要はありません。

粉末の DMEM は大量に使う場合の経済的な選択肢ですが、炭酸水素ナトリウムは入っておらず、溶解時に加える必要があります（標準処方では 3.7 g/L）。濾過中に pH が上がる分を見込んで目標より 0.1–0.2 単位ほど低く調整し、0.22 µm で滅菌濾過します。水は比抵抗 18.2 MΩ·cm 以上でエンドトキシンの低いものを使ってください。

DMEM はフェノールレッドで緩衝状態が見え、しかも透明であるため、たいていの試薬より自分の状態をよく知らせてくれます。これを読めるようになると、インキュベーターを救えます。

細菌のコンタミネーション。 培地が急速に、しばしば一晩で黄色くなり、目に見えて濁ります。顕微鏡下では細胞のあいだに小さな運動性の、あるいは光を強く反射する粒子が見え、密度が上がるときらめく顆粒状になります。診断的な組み合わせは黄色＋濁り＋まばらな、あるいは播種してまもない培養です。細胞がわずかしかないフラスコを、代謝だけでそこまで速く酸性化させることはできません。

酵母のコンタミネーション。 濁りに加え、出芽する卵形の粒子が見えます。pH の低下は細菌より遅いことが多く、均一な白濁ではなく離れた塊として現れがちです。

真菌・カビのコンタミネーション。 糸状の構造が見え、肉眼で分かる綿毛状のコロニーになることもあります。pH はしばらく正常のままのことがあるため、色の確認だけではカビを見落とすことがあります。

マイコプラズマ。 もっとも危険なものです。通常の光学顕微鏡では濁りも色の変化も、生物そのものも見えないからです。培養は正常に見えたまま、増殖速度が落ち、飽和密度が下がり、実験結果がずれていきます。マイコプラズマは培地を見て診断することはできません。PCR、発光を利用した酵素アッセイ、あるいは DNA 染色が必要であり、これこそ定期検査が任意ではなく前提として存在する理由です。

コンタミネーションではないもの。 実験台に置いておいた培地が紫になるのは炭酸水素塩の損失であって感染ではありません。3日前に交換したコンフルエントなフラスコで培地が黄色くなるのは正常な代謝です。低温から常温へ戻したあとの細かい結晶性の析出物は、微生物の増殖ではなく、たいていリン酸カルシウムが溶けきれずに出てきたものです。

リスクを下げる。 培地は使う分量に小分けし、1回のコンタミネーションでボトル1本を失わないようにしてください。取り分けた培地をストックのボトルに戻さないこと。抗生物質の使用は意図的に留めること。ペニシリン/ストレプトマイシンの常用は、低レベルの細菌汚染を目に見えない慢性状態へ押し込め、マイコプラズマには何もしないため、解決したように見えて問題を隠してしまいます。

代謝の実験で高グルコース DMEM を既定にしてしまう。 25 mM のグルコースは薬理学的な濃度であって生理的な濃度ではなく、代謝の表現型を変えます。

DMEM を完全培地だと思い込む。 そうではありません。血清または設計された添加物がなければ、DMEM には脂質、微量元素、トランスフェリン、増殖因子が欠けています。

炭酸水素塩と CO2 のずれを無視する。 上記のとおりで、多くの研究室で静かに播種効率を損なっています。

DMEM/F-12 と DMEM を同じものとして使う。 グルコース、カルシウム、炭酸水素塩、浸透圧、微量元素の含量が違います。一方のデータはもう一方には移せません。

ボトルにグルタミンを足して日付を忘れる。 グルタミンの分解はアンモニアを生み、それは毒性があり蓄積します。添加したその場でボトルに記入してください。

血清入りの培地を誤った膜で滅菌濾過する。 タンパク質が吸着して目詰まりします。低タンパク質吸着膜を使い、プレフィルターを併用してください。

明るい棚に置いたまま保存する。 リボフラビンと HEPES の光分解は、実在する測定可能な細胞毒性の原因です。