α-MEM（MEM アルファ）と最小必須培地 MEM

Harry Eagle は 1959 年、Science 誌に最小必須培地（MEM）を発表しました。哺乳類細胞が培養で実際に何を必要とするのかを、数年かけて系統的に突き止めた成果です。MEM は意図的に最小限です。必須アミノ酸 13 種、ビタミン 8 種、グルコース、そして Earle 平衡塩溶液の無機塩 6 種（塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム）。それだけです。この最小限であることこそが狙いでした。どんな細胞種の要求も、その上に足して確かめられる規定のベースラインになったからです。

α-MEM は「アルファ改変」で、Clifford Stanners、Gerald Eliceiri、Howard Green の三氏が、マウス・ハムスター雑種細胞のリボソームを研究する過程で 1971 年に発表しました。三氏に必要だったのは、DMEM のきわめて高いアミノ酸濃度に踏み込まずに、雑種細胞や要求の厳しい細胞を支えられる、もっと栄養の豊かな培地でした。この改変では、MEM の塩の組成とグルコースはそのまま残し、栄養素を足しています。

• 非必須アミノ酸をすべて——アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、そしてシステイン
• ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L（1 mM）
• アスコルビン酸（ビタミン C）50 mg/L、ビオチン 0.1 mg/L、ビタミン B12 約 1.3 mg/L
• リポ酸 0.2 mg/L
• 選択肢として、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド

こうしてできたのは、栄養面では MEM よりずっと豊かでありながら、イオン組成と CO2 の要求は MEM と同じ培地です。どちらも「栄養を足した MEM」でありながら、α-MEM が DMEM とは違うふるまいをするのは、このためです。

Earle 平衡塩を用いた標準的な MEM の処方です。とくに但し書きなく「MEM」「EMEM」「MEM Eagle」として売られている培地が、これにあたります。

無機塩とその他の成分

アミノ酸（mg/L）——必須アミノ酸 13 種のみ

L-アルギニン·HCl 126、L-シスチン·2HCl 31、L-ヒスチジン·HCl·H2O 42、L-イソロイシン 52、L-ロイシン 52、L-リシン·HCl 73、L-メチオニン 15、L-フェニルアラニン 32、L-トレオニン 48、L-トリプトファン 10、L-チロシン（二ナトリウム塩二水和物として） 52、L-バリン 46。これに L-glutamine 292 が加わります。

ビタミン（mg/L）——8 種

塩化コリン 1、D-パントテン酸カルシウム 1、葉酸 1、ニコチンアミド 1、ピリドキサール·HCl 1、チアミン·HCl 1、i-イノシトール 2、リボフラビン 0.1。

これで培地は全部です。MEM には 非必須アミノ酸も、ヌクレオシドも、ピルビン酸も、アスコルビン酸も、ビオチンも、ビタミン B12 も、リポ酸も、微量元素も、一切入っていません。この最小限は意図的なものです。Eagle の目的は哺乳類細胞が最低限何を要求するのかを確定することであり、それ以外は血清から来る前提でした。ウイルス学、ワクチン製造、栄養要求の研究——足した成分が結果を撹乱してしまう領域——で MEM が今も使われているのも、同じ理由です。

Hanks 平衡塩を用いた MEM もあります。炭酸水素ナトリウムが約 350 mg/L まで下がり、大気の CO2 濃度で使える点を除けば同じ処方です（下の平衡塩の節を参照してください）。よく使われる派生品はほかに二つ、非必須アミノ酸をあらかじめ加えた MEM と、プラークアッセイの重層に用いる 2x MEM があります。

標準的な α-MEM の処方です（ヌクレオシド添加版。ヌクレオシド不含版は、8 種のヌクレオシドを除けば同一です）。

無機塩とその他の成分

アミノ酸（mg/L）

L-アラニン 25、L-アルギニン·HCl 126、L-アスパラギン·H2O 50、L-アスパラギン酸 30、L-システイン·HCl·H2O 100、L-シスチン·2HCl 31、L-グルタミン酸 75、グリシン 50、L-ヒスチジン·HCl·H2O 42、L-イソロイシン 52、L-ロイシン 52、L-リシン·HCl 73、L-メチオニン 15、L-フェニルアラニン 32、L-プロリン 40、L-セリン 25、L-トレオニン 48、L-トリプトファン 10、L-チロシン（二ナトリウム塩二水和物として） 52、L-バリン 46。

ビタミン（mg/L）

アスコルビン酸 50、i-イノシトール 2、塩化コリン 1、D-パントテン酸カルシウム 1、葉酸 1、ニコチンアミド 1、ピリドキサール·HCl 1、チアミン·HCl 1、リボフラビン 0.1、ビオチン 0.1、ビタミン B12 約 1.3。

ヌクレオシド（mg/L、ヌクレオシド添加版の場合）

アデノシン 10、シチジン 10、グアノシン 10、ウリジン 10、チミジン 10、2'-デオキシアデノシン 10、2'-デオキシグアノシン 10、2'-デオキシシチジン·HCl 11。

DMEM との対比で覚えておきたい点が二つあります。α-MEM のグルコースは DMEM の四分の一（1,000 対 4,500 mg/L）で、重炭酸も かなり少なめです（2,200 対 3,700 mg/L、つまり 10% ではなく 5% CO2）。その一方で 栄養の守備範囲は広く、アスコルビン酸、ビオチン、B12、リポ酸、非必須アミノ酸のフルセットを含みます。いずれも DMEM にはありません。α-MEM は弱い DMEM ではなく、設計思想が違う培地です。

α-MEM を発注するときに最も影響が大きい選択がこれで、間違えると選択実験が音もなく壊れます。

細胞はヌクレオチドを二つの経路でつくります。一つは de novo 経路で、プリンとピリミジンを一から組み立て、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）とチミジル酸シンターゼに依存します。もう一つは サルベージ 経路で、できあいのヌクレオシドを HGPRT やチミジンキナーゼなどの酵素で再利用します。培地中のヌクレオシドは、このサルベージ経路を賄います。

サルベージ経路を止めたいとき、あるいは de novo 合成を選択マーカーにするときは、ヌクレオシド不含の α-MEM を使ってください。

• CHO-DXB11 と CHO-DG44 での DHFR 選択。 これらの株は DHFR 欠損で、ヌクレオチドを de novo で合成できません。ヌクレオシドを供給したときだけ生き残ります。つまりヌクレオシド不含の α-MEM そのものが、DHFR を載せた発現ベクターを取り込んだ細胞を見分ける選択圧になります。ヌクレオシドを与えてしまうと、選択は完全に無効になります。これが古典的な用途であり、ヌクレオシド不含の α-MEM がバイオ生産の標準試薬になっている理由です。
• メトトレキサートによる増幅。 理屈は同じです。メトトレキサートは DHFR を阻害しますが、培地中にヌクレオシドがあると、落としたい細胞を救ってしまいます。
• ハイブリドーマでの HAT 選択・HT 選択。 どの経路を使えるようにするかを制御することが目的だからです。

単に栄養の豊かな培地が欲しいだけなら、ヌクレオシド添加版を使ってください。 間葉系間質細胞の日常的な拡大培養、骨髄培養、初代細胞の増殖、そして選択を始める 前 の DHFR 欠損株の維持がこれにあたります。ヌクレオシドはヌクレオチド合成の代謝的な負担を下げ、要求の厳しい初代細胞の増殖をおおむね良くします。

プロトコルにヌクレオシドの記載がまったくなく、選択もしていないなら、添加版のほうが安全な既定値です。プロトコルに DHFR、メトトレキサート、HAT、HT が出てくるなら、慎重に読んでください。答えはたいてい「不含」です。この二つの製品はカタログ名が一語しか違わないため、取り違えが頻発します。

MEM は二種類の塩ベースで供給されており、その違いは「培養をどこに置くつもりか」に尽きます。

Earle 平衡塩の MEM は炭酸水素ナトリウムを 2,200 mg/L 含み、5% CO2 のインキュベーター向けに設計されています。実験室で標準的なのはこちらで、但し書きのない「MEM」はこれを指します。α-MEM もこのベースを使っています。

Hanks 平衡塩の MEM は炭酸水素ナトリウムが約 350 mg/L しかなく、密閉容器の中、または大気の CO2 濃度で使うことを前提としています。歴史的には組織の輸送、密閉フラスコでの培養、実験台の上で行う操作のためのものでした。Hanks ベースの MEM を通気キャップのフラスコに入れて 5% CO2 のインキュベーターに置けば、pH は緩衝能の下限を割り込んで落ちていきます。

この決まりは MEM に限りません。重炭酸濃度とインキュベーターの CO2 濃度は対になっています。これらの培地の pH は、重炭酸と溶存 CO2 の比で決まるからです。データシートで思ったより低い重炭酸の値を見つけたら、インキュベーターに入れる前に、その製品が Hanks ベースあるいは密閉容器用の処方でないかを確認してください。

間葉系間質細胞（MSC）。 α-MEM は、ヒトおよび動物の骨髄由来・脂肪由来 MSC の拡大培養で標準のベースです。通常は 10–20% の FBS か、規定の添加物と組み合わせます。グルコースが低いことは、ここでは長所です。高グルコースが MSC の増殖能と分化能に影響することは報告されています。

骨系・造血系の培養。 骨芽細胞、破骨細胞の分化アッセイ、骨髄ストローマ培養、長期骨髄培養では、慣習的に α-MEM が使われます。アスコルビン酸を含むことは骨芽細胞の実験に直結します。コラーゲンの水酸化と基質の沈着に、アスコルビン酸が必要だからです。

CHO-DXB11 と CHO-DG44。 前述のとおり、ヌクレオシド添加版と不含版の α-MEM は、これらの生産株での DHFR 選択とメトトレキサート増幅における標準的な組み合わせです。

初代細胞全般。 軟骨細胞、歯髄細胞、ケラチノサイト用のフィーダー層、初代線維芽細胞など、多くの初代培養は、素の MEM より α-MEM のほうがよく育ちます。非必須アミノ酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、ヌクレオシドがあるためです。

素の MEM は、最小限で素性のはっきりしたベースが欲しい場面で今も使われます。Vero や MRC-5 でのウイルス学とワクチン製造、プラークアッセイ、そして足した成分が結果を撹乱してしまう栄養要求の研究です。

カルシウムには注意してください。α-MEM は 1.8 mM で、DMEM と同じです。接着系や分化させる培養には向きますが、低カルシウムを指定するケラチノサイトのプロトコルには不向きなベースになります。

CO2。 α-MEM の重炭酸 2,200 mg/L（26 mM）は 5% CO2 に合わせてあります。これは標準的なインキュベーターの設定なので、α-MEM は DMEM より最初から pH を予測どおりに保てます。

グルタミン。 グルタミン含有版では 2 mM（292 mg/L）です。溶液中でアンモニアに分解するため、グルタミン不含の培地を買って使用時に新しく加えるか、安定なジペプチドである L-alanyl-L-glutamine を使うほうが、長期の培養が安定します。培養が何週間も続く MSC の拡大培養では、とくに効いてきます。

血清。 10% FBS が一般的です。MSC のプロトコルでは 15–20% を指定することが多く、臨床グレードの実験では規定の添加物やヒト血小板ライセートを使う例が増えています。

アスコルビン酸の安定性。 α-MEM のアスコルビン酸 50 mg/L は本当に役に立ちますが、本当に不安定でもあります。溶液中で数日から数週間のうちに酸化します。アスコルビン酸がコラーゲンの沈着を駆動する骨分化誘導では、開けてから一か月経ったボトルに残っている分をあてにせず、アスコルビン酸 2-リン酸を新しく加えてください。分化誘導のプロトコルでアスコルビン酸 2-リン酸という安定化型が使われるのは、まさにこの理由からです。

保存。 遮光して 2–8 °C、未開封で 12–24 か月が一般的です。グルタミンを加えたあとはおよそ 4 週間です。α-MEM は素の MEM より光に弱くなります。アスコルビン酸、リボフラビン、葉酸がいずれも光で分解するからです。扉のある冷蔵庫に入れてください。

粉末の α-MEM は炭酸水素ナトリウムを含まない形で供給されます。溶解時に 2.2 g/L を加え、濾過中に pH が上がるぶんを見込んで目標より約 0.2 単位低く調整し、0.22 µm で滅菌濾過してください。

ヌクレオシドの版を間違えて発注する。 この二つの製品はカタログ名が一語違うだけですが、DHFR 選択やメトトレキサート選択でのふるまいはまったく別物です。棚のラベルではなく、データシートを確認してください。

α-MEM を低グルコースの DMEM だと思い込む。 違います。重炭酸が違い（2,200 対 3,700 mg/L）、必要な CO2 濃度が違い、ビタミンの構成も違います。さらに DMEM にはないヌクレオシド、アスコルビン酸、リポ酸、ピルビン酸を含みます。

分化実験で、ボトルに入っているアスコルビン酸をあてにする。 溶液中のアスコルビン酸は分解します。骨分化誘導では、アスコルビン酸 2-リン酸を新しい添加物として使ってください。

Hanks 平衡塩の MEM を CO2 インキュベーターに入れる。 重炭酸 350 mg/L では 5% CO2 で緩衝できず、培養は酸性に振れます。

研究の途中で MSC 培養を α-MEM と DMEM のあいだで乗り換える。 グルコース、カルシウム、微量栄養素がまとめて変わり、それにつれて増殖速度と分化能も動きます。