HEPES 緩衝液（細胞培養用）

HEPES は 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid、CAS 7365-45-9、遊離酸の分子量は 238.30 g/mol です。1960 年代に Norman Good らが報告した両性イオン緩衝剤の一群に属します。この一群は生物学的な用途のために、いくつかの基準に照らして選ばれました。生理的な範囲の pKa、高い水溶性、細胞膜をほとんど透過しないこと、可視光と近紫外での吸収が小さいこと、化学的な安定性、そして金属イオンと錯体を作りにくいことです。

この設計基準こそ、より古い有機緩衝剤ではなく HEPES が使われる理由です。細胞膜を自由に通る緩衝剤は、培地と同時に細胞質まで緩衝してしまい、細胞内 pH を乱します。カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄をキレートする緩衝剤は処方から微量金属を奪い、生物学的な結果に見える形で細胞の挙動を変えてしまいます。HEPES はこの2つをかなりうまく避けており、それが哺乳類培養における補助緩衝剤の定番になった理由です。

HEPES は化学的に異なる2つの形で販売されており、ストックを調製するときにこの違いが効いてきます。遊離酸（分子量 238.30）は溶かすと強い酸性の溶液になるため、水酸化ナトリウムで滴定して使用 pH まで上げる必要があります。ナトリウム塩（HEPES-Na、分子量 260.29）は溶かすと塩基性になるため、塩酸で下げます。細胞培養用に供給される既製の 1 M 溶液はすでに pH 7.0–7.6 の範囲へ滴定され滅菌濾過されているので、滴定の手間もナトリウム負荷の不確かさもなくなります。

よく誤解される点がひとつあります。HEPES は緩衝剤であって栄養素ではありません。細胞の代謝には何も寄与しません。対して炭酸水素イオンは緩衝剤であると同時に代謝基質でもあり、細胞が実際に必要とするカルボキシル化反応を支えます。HEPES が重炭酸緩衝系を置き換えるのではなく補うものである理由は、ここにあります。

HEPES の pKa は 25 °C でおよそ 7.48 で、おおよそ pH 6.8 から 8.2 の範囲で有効に緩衝します。緩衝剤は pKa の前後およそ 1 pH 単位の範囲でもっとも良く働きます。培養の生理的 pH である 7.2–7.4 は、HEPES の pKa のほぼ真上に乗っています。HEPES が使われる理由はまさにここにあります。細胞が必要とするちょうどその位置で、緩衝能が最大になっているのです。

実務でやっかいなのは、HEPES の pKa が温度に依存し、1 °C 上がるごとにおよそ 0.014 pH 単位ずつ下がることです。この影響は具体的で、実際によく人を引っかけます。22 °C の実験台で pH 7.4 に滴定した HEPES 溶液は、37 °C のインキュベーターで平衡に達すると pH 7.2 に近い値を示します。作業温度での pH が実験の前提になるのであれば、37 °C で滴定するか、室温であえて高めの設定値へ滴定したうえで、使用前に 37 °C での値を確認してください。

供給元の資料に載る pKa の値は少しずつ違います（37 °C で 7.31、25 °C で 7.48、20 °C で 7.55 のいずれもが流通しています）。これは異なる温度とイオン強度で報告されているためで、互いに矛盾しているわけではありません。同じ温度曲線を別の点で切り取っているだけです。実務で意味を持つのは、ずれの向きとおおよその大きさであって、小数第3位ではありません。

イオン強度も実効 pKa をわずかに動かします。生理的なイオン強度の完全培地では、緩衝の挙動は表の値に十分近く、補正する価値があることはまれです。ただしこれもまた、ストックの値を信じるのではなく最終処方で pH を確認すべき理由のひとつです。

哺乳類細胞培養での使用範囲は 10–25 mM です。単独の選択としては 25 mM がもっとも多く、感受性の高い初代細胞や長期の培養では 10–15 mM が好まれます。およそ 25 mM を超えると利点は頭打ちになり、後述するリスクのほうが優勢になります。50 mM 以上の濃度は多くの株に細胞毒性を示し、日常の培養では使いません。

1 M ストックからの希釈は単純です。

HEPES 入りの処方を購入するのではなく、完成した培地にあとから加える場合には、2点を勘定に入れる必要があります。

浸透圧が上がります。 1 M の HEPES 溶液は加えられる培地よりはるかに濃く、加えれば総浸透圧が上がります。哺乳類用の培地は通常 260–320 mOsmol/kg あたりに収まっており、使用範囲の上限で HEPES を加えると、もともと上限に近かった処方をそこから押し出してしまうことがあります。「HEPES 入り」として販売される培地は塩化ナトリウムを減らして補正していますが、自分で添加した培地はそうではありません。浸透圧に敏感な細胞を扱うなら、実測してください。

ナトリウム負荷が上がります。 HEPES 遊離酸を pH 7.4 まで滴定するにはおよそ1当量の水酸化ナトリウムが必要なので、25 mM の HEPES 添加はそれに見合う量のナトリウムを持ち込みます。日常の培養では無視できますが、電気生理や浸透圧を厳密に管理する実験ではそうではありません。

HEPES を加えるときに、処方から炭酸水素ナトリウムを抜かないでください。標準的な構成は、インキュベーターに合わせた濃度の炭酸水素塩に HEPES を上乗せする形であり、どちらも役に立つ働きをしています。

古典的な培地のほとんどで既定の緩衝剤は、インキュベーター気相の CO2 と組んで働く炭酸水素ナトリウムです。溶存 CO2 は水和して炭酸となり、炭酸水素イオンとプロトンに解離します。培地が落ち着く pH は、培地中の炭酸水素イオン濃度と溶存 CO2 濃度の比で決まります。だからこそ、処方の炭酸水素塩含量はインキュベーターのガス設定と対にしなければなりません。炭酸水素ナトリウム 3.7 g/L の DMEM は 10% CO2 環境用に設計されており、1.5–2.2 g/L の処方は 5% CO2 用です。3.7 g/L の処方を 5% CO2 で運転すると、培地は恒常的にアルカリ側へ留まります。

重炭酸緩衝系の弱点は、その半分が気体であることです。フラスコをインキュベーターから出せば、CO2 は培地から室内の空気へ抜けていきます。室内の空気に含まれる CO2 はおよそ 0.04% しかありません。炭酸水素イオンは残るので比が動き、pH は上がります。安全キャビネットの中では、炭酸水素塩だけの培地は 10 分から 20 分ほどで目に見えてアルカリ側へ振れます。フェノールレッドが入っていれば、培地が赤から紫へ移っていくのをそのまま観察できます。

HEPES には揮発する成分がありません。緩衝能は加えた量で決まり、周囲の気相が何をしていようと関係ありません。これが HEPES を価値あるものにしている唯一の性質であり、HEPES を使う価値のある場面のすべてを説明します。

代償は、HEPES が炭酸水素イオンを供給しないことです。細胞はこれをカルボキシル化反応で消費します。また、生理的な緩衝化学を再現するものでもありません。炭酸水素塩を完全に外して HEPES に置き換えると、多くの株で増殖が遅くなるか止まります。ほとんどの場合、正しい構成は両方を使うことです。

HEPES が本領を発揮するのは、細胞が管理された CO2 環境の外でまとまった時間を過ごす場合です。

• ガス制御のないステージでのライブセルイメージング。 大気中で1時間以上のタイムラプスを回す、典型的な場面です。20–25 mM の HEPES がその間の pH を保ちます。
• フローサイトメトリーとセルソーティング。 ソートは長時間かかり、サンプルは大気の CO2 濃度のままチューブの中で待ちます。pH の変動は測定が終わる前に生存率を落とします。
• 初代組織の解離。 消化は実験台の大気下で行い、30 分から数時間かかることもあります。HEPES で緩衝した解離用培地や保持用培地は、まさにこのために存在します。
• 生きた培養の輸送。 建物間を移動するフラスコや翌日配送のフラスコには CO2 の供給がありません。HEPES と、ガスを充填せず液で満たしたフラスコが標準的なやり方です。
• 頻繁な操作や長い操作。 安全キャビネット内での工程が多いプロトコルでは、アルカリ側への変動が積み重なります。HEPES はそれをならします。
• 神経細胞やスライスの実験。 長時間の電気生理や神経細胞の保持用培地では、まさにこの理由で HEPES が日常的に使われます。

逆に、5% CO2 インキュベーターに入れて週2回の培地交換をするだけで、あとは触らない培養であれば、HEPES はごくわずかな利点のためにコストと光化学的な危険を足すだけです。日常的な添加成分ではなく、特定の問題への解です。

光の問題は現実のもので、もっとも見落とされています。 Zigler らは 1985 年に、RPMI 1640 に HEPES を加えると、培地を可視光にさらしたときの細胞毒性産物の生成が著しく増えることを示し、主要な細胞毒性因子として過酸化水素を同定しました。この反応に必要なのは HEPES とリボフラビン、そして光だけで、他の培地成分は必要ありません。彼らの実験では、細胞を加える前に培養培地の半量を3時間光にさらしただけで、チミジンの取り込みが完全に阻害されました。

そこから導かれる実務上の規則は単純です。HEPES のストックと HEPES 入りの培地は暗所で保管すること。ボトルを実験台の光の下に長く置かず、照明の当たる顕微鏡ステージにも必要以上に置かないこと。そして、照明の下に置かれていた HEPES 添加培地で説明のつかない毒性が出たら、まずそれを疑うことです。ほぼすべての供給元が HEPES に「遮光保存」の指示を付けているのは、この理由からです。

濃度に依存した細胞毒性。 10–25 mM の使用範囲を超えると、HEPES 自体が多くの細胞種にとって問題になります。すべての株に当てはまる単一のしきい値はありません。25 mM を超えて使うのであれば、想定で済ませず、自分の系で生存率を指標に振ってください。

アッセイへの干渉。 HEPES はあらゆる条件で化学的に不活性というわけではありません。ラジカル反応に関与し、一部の金属酸化物に対して還元剤として働くことがあり、スルホン酸基が特定のタンパク質定量や金属結合アッセイに干渉することがあります。緩衝液に敏感なアッセイで予想外の結果が出たときは、緩衝剤は正当な容疑者です。

HEPES は無菌性や安定性の代わりにはなりません。 グルタミンの分解を遅らせることも、微生物の増殖を防ぐことも、培地の使える期間を延ばすこともありません。

遊離酸から 1 M の HEPES を 1 L 作るには、238.30 g をおよそ 800 mL の細胞培養グレードの水に溶かし、水酸化ナトリウム（希釈を抑えるため通常 5 M または 10 M）で目標 pH に滴定し、1 L にメスアップしてから 0.22 µm のフィルターを通して滅菌します。細胞培養用のストックでは、オートクレーブより滅菌濾過が推奨されます。加熱処理は HEPES 溶液を変色させることがあり、そのリスクに見合う利点はありません。

仕上がりの品質を左右する点は次のとおりです。

1. 素性の分かった水を使う。 HEPES ストックは細胞が生きる培地に直接入るので、水の質はそのまま持ち込まれます。エンドトキシン量が規定された細胞培養グレードの蒸留水が正しい入力であり、エンドトキシン量の分からない実験室の脱イオン水では役目を果たしません。
2. 使う温度で滴定する。 上の pKa の項を参照してください。室温での読みはインキュベーターでの値ではありません。
3. オートクレーブせず濾過する。 0.22 µm で行い、日付を記入します。
4. 冷暗所で保管する。 液体ストックは 2–8 °C の遮光が通常の条件です。粉末はより寛容で、通常は室温の遮光で保管します。
5. エンドトキシンに注意する。 緩衝液は、培養へエンドトキシンが入り込む経路としてよくあるにもかかわらず、確認されにくいものです。エンドトキシンに敏感な実験（初代免疫細胞、幹細胞、規制対象の用途に向かうもの）であれば、素性の不明な試薬から作ったものではなく、エンドトキシン規格が明示されたストックを使ってください。

粉末から大量の培地を作る研究室では、HEPES をバルクの粉末で購入して自前で滴定するほうが、滅菌済みの 1 M 溶液を買うよりモルあたりで大幅に安くなります。完成培地のボトルを少しずつ補う研究室では、滅菌済みの 1 M 溶液が現実的な選択です。秤量も滴定も濾過工程もなく、自家調製のストックで培地のバッチを汚染する余地もありません。