ACK溶解バッファー

ACK溶解バッファーは化学的にごく単純です。水に3種類の溶質を溶かし、生理的な pH に合わせるだけです。

標準 1X ACK溶解バッファー（1 L あたり）

0.22 ミクロンのメンブレンで濾過します。保存は遮光下 2-8 °C、常温保存品として供給されるものは 15-30 °C です。市販の ACK はどちらの条件でも販売されていますので、必ずラベルを確認してください。

市販品の組成にはわずかな違いがあり、その違いは実在します。 Lonza の使用説明書は NH4Cl 8,024 mg/L、KHCO3 1,001 mg/L、EDTA.Na2.2H2O 3.722 mg/L と規定しています。EDTA 量は、多くの公表レシピが挙げる 0.1 mM の 10 分の 1 です。Gibco の ACK Lysing Buffer は pH 7.0-7.7、浸透圧 280-320 mOsmol/kg と規定され、塩化アンモニウム量も 150 mM ではなく 155 mM と記載されることがよくあります。いずれの差もバッファーの挙動を変えるほど大きくはありません。ただし公表された方法をそのまま再現するのであれば、すべての ACK が同じだと考えず、その方法が用いたレシピに従ってください。

最も質問が多い成分は EDTA です。これは溶血を起こす濃度ではなく、キレート剤としての濃度で入っています。二価陽イオンを結合して陽イオン依存性の凝集を防ぎ、白血球懸濁液を単細胞の状態に保つのが役割です。溶血そのものにはほとんど寄与せず、溶血を駆動しているのは塩化アンモニウムです。

「10X」についての注意。 ACK は通常 1X で供給され、そのまま使用します。一部のメーカーは、使用前に水で希釈する 10X 濃縮液を販売しています。10X ストックは等張ではありませんので、希釈せずに細胞へ加えることは絶対に避けてください。

ACK の選択性は、赤血球が壊れやすいから生まれるわけではありません。成熟赤血球が大量に持ち、白血球が持たない2種類のタンパク質による結果です。

溶液中の塩化アンモニウムは、アンモニアとプロトンとの平衡状態にあります。電荷を持たないアンモニアは赤血球膜を自由に通過します。細胞内でプロトンを受け取ってアンモニウムとなり、細胞内プロトンを消費して、炭酸脱水酵素が触媒する二酸化炭素と重炭酸イオンの平衡を移動させます。赤血球は炭酸脱水酵素活性が非常に高いため、この平衡移動は速く進みます。

生じた重炭酸イオンは、赤血球の陰イオン交換体である band 3（AE1）によって細胞外の塩化物イオンと交換されます。band 3 は1細胞あたりおよそ100万コピー存在し、電気的に中性な1対1の重炭酸／塩化物交換を触媒します。この一連のループは Jacobs-Stewart サイクルと呼ばれ、正味の結果として塩化アンモニウムが細胞内に蓄積し続けます。浸透圧に従って水が流入し、細胞は膨張し、膜が破綻します。

白血球には、このサイクルを意味のある速度で回すだけの炭酸脱水酵素活性も band 3 密度もありません。アンモニアをいくらか取り込んで細胞内 pH が一過性に上昇はしますが、プロトコルが走る数分のあいだに膨張して破裂するほど速く溶質を蓄積できません。だからこそ時間管理がこれほど重要になります。ACK における赤血球と白血球の差は速度論的なものであって、絶対的なものではありません。長く置けば白血球も傷みます。

このしくみから、2つの帰結が直接導かれます。第一に、溶血は氷上よりも室温のほうが速く進みます。サイクルのどの段階も温度依存だからです。バッファーを冷たいまま使うことが、溶血が不十分に見える最も多い原因です。第二に、白血球が受ける一過性の細胞内アルカリ化は、生物学的に無害とは言えません。カルシウムフラックス、酸化バースト、貪食能など細胞質 pH に敏感な機能アッセイでは、塩化アンモニウム溶血よりも密度勾配分離のほうが安全な選択になることが多くあります。

これは ACK が本来設計された用途です。以下の量は成体マウス1匹分の脾臓を想定しています。

1. 単細胞懸濁液をつくります。 組織を 70 ミクロンのセルストレーナーに載せ、シリンジの内筒で冷やした PBS または無血清培地の中へ押し出します。ストレーナーは洗い流します。
2. 細胞をペレット化します。 4 °C、300-400 x g で 5 分間遠心します。上清は完全に吸引除去してください。残った上清は溶解バッファーを薄め、反応を遅らせます。
3. ACK に再懸濁します。 脾臓1個あたり 1-3 mL の 1X ACK溶解バッファーを加えます。Lonza の説明書は、あらゆるペレットに使える一般則として、ペレットの容量と同程度の ACK を加えるとしています。静かに、完全に再懸濁してください。塊が残ると溶血が不均一になります。
4. インキュベートします。 室温で1-5分、静かに混ぜながら置きます。Lonza のプロトコルはチューブを 30-60 秒振り混ぜるよう指定しています。多くの研究室では懸濁液を見ながら、不透明な赤色から透き通った赤色に変わった時点で止めます。通常1-2分です。5分を超えてはいけません。
5. 希釈して反応を止めます。 ただちに PBS または無血清培地でチューブを 10 倍容量以上まで満たします。ACK を止めるのは中和ではなく希釈です。
6. 洗浄します。 300 x g で 5 分間遠心し、上清を捨てます。ペレットは白色か淡いピンク色になっているはずです。
7. 必要なら繰り返します。 ペレットがまだ目に見えて赤い場合は、手順3-6をもう一度繰り返します。脾臓では2回目までは普通です。3回目が必要なら、それ以前の段階に問題があります。多くは再懸濁不足か、バッファーが冷たかったことです。
8. 濾過して計数します。 40-70 ミクロンのストレーナーに通してデブリと溶解細胞の凝集塊を除き、トリパンブルーで計数して次の工程に進みます。

骨髄も同じプロトコルですが、赤血球の負荷が低いためインキュベーションは短くし、通常 30-90 秒とします。

バフィーコートや希釈血液は、試料に対してより多くのバッファーと長いインキュベーションが必要です。通常は充填細胞1容量あたり 10-20 容量の ACK を用い、室温で5-10分置きます。全血の扱いはメーカーによって見解が分かれます。Gibco は EDTA 処理した全血を想定試料に挙げていますが、Lonza の使用説明書は全血の溶血に本製品を使用しないと明記しています。実際に購入した製品に添付された説明書に従ってください。

溶血が不完全でペレットが赤いまま。 頻度の高い順に、バッファーを冷蔵庫から出してそのまま冷たい状態で使った（先に室温へ戻します）、ペレットの再懸濁が不完全でバッファーの届かない塊が残っている、赤血球量に対してバッファーが少なすぎる、残った上清が多すぎてバッファーを薄めている、期限切れまたは凍結融解を繰り返したバッファー、という原因が挙がります。残存赤血球は見た目の問題では済みません。フローサイトメーターの流路を詰まらせ、自動計数値をゆがめ、下流の標本にデブリを持ち込みます。

溶血のしすぎ — 生存率が下がり、収量も落ちます。 最も多いプロトコル上の誤りは、細胞を ACK に長く置きすぎることです。およそ5分を超えると白血球が膨張して死に始め、顆粒球が最初に影響を受け、フローサイトメトリーの染色に影響するほど表面エピトープが失われたり変化したりします。組織の取り扱いが適切だったのに新鮮な脾臓標本の溶血後生存率が 85-90% を下回るなら、まず溶血の工程を疑ってください。

溶血後に細胞が凝集する。 通常の原因は、溶解した細胞から出た遊離 DNA です。洗浄工程に DNase I を加えるか、洗浄バッファーに EDTA を入れれば、たいてい解決します。最終洗浄の直後に 40 ミクロンのストレーナーへ通せば、すでに形成された凝集塊を除けます。

下流の酵素反応が動かない。 溶解バッファーから持ち越された EDTA がカルシウムとマグネシウムをキレートし、次に使う二価陽イオン依存性の酵素を阻害します。制限酵素、一部のバッファー系でのポリメラーゼ、そしてとくにコラゲナーゼやディスパーゼです。酵素工程の前には二価陽イオンを含むバッファーで2回洗浄し、ACK 処理した細胞をディスパーゼやコラゲナーゼ消化へ直接持ち込むことは絶対に避けてください。

機能アッセイの挙動がおかしい。 前述の一過性の細胞内アルカリ化は、活性化状態、カルシウム動態、呼吸バーストの測定値を変えることがあります。機能的な測定値がフローの表現型と食い違うなら、生物学的な結論を出す前に、同じドナー由来の密度勾配分離細胞と比較してください。

数日後にコンタミネーションが出る。 ACK は抗菌活性も保存剤も持たない単純な水溶液です。濾過していない水から自家調製したり、共用ボトルから繰り返し分注したりすれば、清潔だったはずの標本に汚染を持ち込む格好の媒体になります。0.22 ミクロンで濾過し、小分けし、培地と同じ注意を払って扱ってください。

塩化アンモニウムは皮膚・眼・気道への刺激物であり、飲み込むと有害です。ここで使う濃度の溶液は穏やかですが、固体はそうではなく、秤量すると粉じんが立ちます。ドラフト内または局所排気のもとで秤量し、保護眼鏡を着用し、粉末を吸い込まないようにしてください。

塩化アンモニウム溶液を次亜塩素酸系の漂白剤と混ぜてはいけません。 本来は穏やかな試薬である ACK に伴う、唯一の本当に重大な危険がこれです。アンモニウム塩は次亜塩素酸と反応してクロラミンガスを生じ、これは吸入すると有毒です。廃液アスピレーターを漂白剤で消毒している研究室では、ACK 廃液が漂白剤トラップへ流れ込むことが現実のクロラミン発生リスクになります。塩化アンモニウム廃液は分別して廃棄するか、次亜塩素酸に達する前に十分に水で希釈してください。

強塩基との接触も、同じ理由でアンモニアガスを発生させます。

免疫学ではエンドトキシンが問題になります。 ACK はほぼ免疫細胞にしか使われませんが、免疫細胞はリポ多糖の汚染に最も敏感な細胞です。エンドトキシン量が不明な実験室の脱イオン水から調製したバッファーは、これから表現型を調べようとしている細胞そのものをプライミングあるいは活性化してしまい、その影響は生物学的な現象のように見えます。エンドトキシン規格が明示された細胞培養グレードの水を使い、機能的免疫学の実験では、エンドトキシン上限が文書化された市販バッファーを使ってください。

保存と安定性。 調製して濾過した ACK は、冷蔵・遮光で数か月は安定です。市販の 1X バッファーの有効期間は通常 12 か月です。凍結融解を繰り返さないでください。濁りや浮遊物が生じたボトルは廃棄してください。

赤血球を除く方法は ACK だけではありませんし、常に最良というわけでもありません。

低張（水）溶血は同じ浸透圧の原理を使いますが、やり方は粗いものです。蒸留水に短時間さらしたあと、濃厚食塩水で張度を戻します。水と 10X PBS 以外の試薬が要らず安価ですが、赤血球が溶けてから白血球が傷むまでの猶予が ACK よりずっと狭く、操作者間の再現性も低いままです。あくまで代替手段として残っている方法です。

密度勾配分離（Ficoll-Paque、Percoll、Lymphoprep）は、何かを溶かすのではなく浮遊密度の差で赤血球と顆粒球をまとめて除きます。より穏やかで、白血球をアンモニウムにも細胞内 pH の変動にもさらさないため、機能アッセイにはこちらが適切です。代償は、時間、検体あたりのコスト、顆粒球が必要な場合にはそれを失うこと、そして大規模に再現性よく走らせるのが難しいことです。

市販の固定・溶血一体型試薬は、臨床フローサイトメトリーで赤血球の溶血と白血球の固定を一度に行います。全血の免疫表現型解析には優れていますが、そのあとに生細胞が必要な場合には使えません。

溶血しないという選択も、下流の手法が赤血球を許容するなら正当です。たとえば一部の磁気ビーズ分離は、赤血球の有無を問いません。

ACK が本来担う仕事、すなわち培養・ソーティング・養子移入に用いる生存性の高いマウス脾細胞や骨髄細胞の調製においては、速く、安く、十分に穏やかで、時間さえ守れば再現性が高いという理由から、ACK は今も標準であり続けています。