Cómo elegir DMEM para su línea celular
Una corrida de transfección de HEK293T puede parecer normal a las 24 horas y aun así no alcanzar el rendimiento a las 72 horas si la elección de DMEM es incorrecta. La división habitual es alta glucosa, 4.5 g/L, frente a baja glucosa, 1.0 g/L, pero phenol red, pyruvate, HEPES y la química de glutamine a menudo importan tanto como eso. Esta guía comienza con reglas prácticas de selección y luego muestra controles de QC medidos, como pH 7.21, osmolalidad 312 mOsmol/kg y viabilidad de HEK293T de 96.3% a las 96 horas.
El problema (con un ejemplo específico)
Un caso común: HEK293T (ATCC CRL-3216) crece bien en DMEM de alta glucosa durante el pase rutinario, luego cae de 92% a 78% de viabilidad después de un cambio de reactivo que eliminó discretamente sodium pyruvate y cambió de glutamine estable a L-glutamine libre.
Eso no es una falla misteriosa de la línea celular. Es un desajuste de formulación.
La selección de DMEM suele decidirse en seis dimensiones: nivel de glucosa, phenol red, forma de L-glutamine, sodium pyruvate, HEPES y conjunto de aminoácidos. La alta glucosa, 4.5 g/L, soporta líneas glucolíticas rápidas y cultivos densos. La baja glucosa, 1.0 g/L, a menudo es un mejor punto de partida cuando las células muestran acumulación de lactato, morfología alterada o lecturas sensibles al metabolismo.
- Glucosa: 4.5 g/L para HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96) y muchos flujos de trabajo de alta densidad. 1.0 g/L para estudios más lentos de tipo primario o sensibles al metabolismo.
- Phenol red: manténgalo para cultivo rutinario y deriva visual del pH. Elimínelo para imagen de fluorescencia, ensayos sensibles a hormonas o lecturas de reporteros débiles.
- L-glutamine: la L-glutamine libre es convencional, pero el dipéptido de glutamine estable reduce el aumento de amoníaco durante alimentaciones más prolongadas.
- Sodium pyruvate: útil a 1.0 mM para amortiguación del estrés oxidativo y recuperación. Omítalo cuando pyruvate afecte los ensayos de flujo metabólico.
- HEPES: útil a 10 a 25 mM para manejo con bajo CO2, microscopía y períodos de transporte fuera de una incubadora con 5% CO2.
- Conjunto de aminoácidos: el DMEM estándar es adecuado para mantenimiento rutinario, la modificación ATCC ayuda a coincidir con protocolos heredados de bancos celulares, y los conjuntos avanzados de aminoácidos soportan cultivos de mayor densidad o propensos al estrés.
Mecanismo (figura 1, figura 2)
Figura 1, presión de glucosa y lactato. El DMEM de alta glucosa comienza con 4.5 g/L de glucosa, lo que da a las células de crecimiento rápido una mayor reserva de carbono. La contrapartida es la formación de lactato. En cultivos densos de HEK293T (ATCC CRL-3216) o HeLa (ATCC CCL-2), el lactato por encima de 20 a 25 mM a menudo coincide con crecimiento más lento, deriva del pH por debajo de 7.0 y agotamiento más temprano del medio.
Figura 2, química del tampón y del nitrógeno. El DMEM tamponado con bicarbonato está diseñado en torno al control de CO2. HEPES añade capacidad tamponante durante el manejo en mesa o la imagen de células vivas, donde la placa puede permanecer al aire ambiente durante 30 a 90 minutos. La química de glutamine importa porque la L-glutamine libre se descompone durante el almacenamiento y el cultivo, mientras que la glutamine estable puede reducir la carga de amoníaco en corridas de 72 a 120 horas.
Pyruvate se sitúa en un punto de decisión diferente. Puede apoyar la recuperación del estrés oxidativo y dar a las células una fuente adicional de carbono, pero también puede enmascarar fenotipos mitocondriales. Para ensayos metabólicos tipo Seahorse, trazado de lactato o estudios de respuesta a pyruvate, comience con DMEM sin pyruvate y añada pyruvate como una variable controlada.
La lógica basal es antigua, pero sigue siendo útil. El trabajo de nutrientes definidos de Eagle estableció por qué los aminoácidos, las vitaminas, las sales y la glucosa deben tratarse como variables experimentales activas en lugar de ingredientes de fondo [1] Eagle H. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.
Métodos de medición
No elija DMEM solo por el nombre. Confirme los valores medidos del lote y luego hágalos coincidir con la línea celular y el ensayo.
| Medición | Valor típico de liberación | Rango de aceptación | Por qué importa |
|---|---|---|---|
| pH a 20 a 25°C | 7.21 | 7.0 a 7.4 | Señala desajustes de CO2 y tampón antes de que comience el cultivo |
| Osmolalidad | 312 mOsmol/kg | 260 a 320 mOsmol/kg | Los valores altos estresan a MDCK (ATCC CCL-34) y MRC-5 (ATCC CCL-171) |
| Endotoxina, LAL | ≤0.25 EU/mL | ≤0.50 EU/mL | Importante para lecturas inflamatorias y epiteliales |
| Mycoplasma, qPCR | No detectado | No detectado | Protege los datos de tasa de crecimiento y transcriptómicos |
| Esterilidad | USP <71> aprobado | Sin crecimiento | Requerido para la liberación a cultivo rutinario |
| Promoción del crecimiento | HEK293T 96.3% de viabilidad a 96 h | ≥90.0% de viabilidad | Comprueba que la formulación soporta una línea sensible de crecimiento rápido |
Para la elección de glucosa, mida el medio usado después de 48 y 72 horas. Si la glucosa permanece por encima de 1.5 g/L pero el lactato supera 22 mM, cambiar a una densidad de nutrientes aún mayor rara vez es la respuesta. Si la glucosa cae por debajo de 0.5 g/L mientras la viabilidad permanece por encima de 90%, una estrategia de alta glucosa o alimentación es más defendible.
Umbrales de tolerancia por tipo celular (tabla)
| Línea celular | Punto de partida típico de DMEM | Preferencia de glucosa | Pyruvate | Phenol red | Nota sobre HEPES |
|---|---|---|---|---|---|
| HEK293T (ATCC CRL-3216) | DMEM de alta glucosa con L-glutamine | 4.5 g/L | Opcional, a menudo 1.0 mM para recuperación | Presente para pase rutinario, ausente para imagen | 10 a 25 mM si las placas salen de CO2 para el manejo de transfección |
| HeLa (ATCC CCL-2) | DMEM de alta glucosa, aminoácidos estándar | 4.5 g/L | Generalmente tolerado | Eliminar para fluorescencia o trabajo sensible a estrógenos | Útil durante sesiones de microscopía de más de 30 min |
| MRC-5 (ATCC CCL-171) | DMEM de baja glucosa o modificación heredada coincidente | 1.0 g/L | Usar con cautela si se monitorizan marcadores de senescencia | Presente para cultivo rutinario de fibroblastos | Evitar el exceso de tampón salvo que se necesite manejo con bajo CO2 |
| Vero (ATCC CCL-81) | DMEM de alta glucosa para expansión | 4.5 g/L | A menudo útil durante la recuperación tras descongelación | Presente salvo que el punto final de imagen requiera ausencia de colorante | Bueno para transporte y preparación de infección fuera de la incubadora |
| MDCK (ATCC CCL-34) | DMEM de baja a moderada glucosa, control osmótico estricto | 1.0 g/L primero, luego optimizar | Dependiente del ensayo | Eliminar para imagen de barrera | Usar cuando el trabajo en placa abierta exceda 45 min |
| HepG2 (ATCC HB-8065) | DMEM de alta glucosa con pyruvate | 4.5 g/L | Comúnmente 1.0 mM | Ausente para ensayos de fluorescencia metabólica | Útil porque los ensayos hepáticos a menudo implican manejo prolongado |
| U-2 OS (ATCC HTB-96) | DMEM de alta glucosa, opción de grado imagen | 4.5 g/L | Opcional | Ausente para fluorescencia de células vivas | Recomendado para imagen de lapso de tiempo fuera de 5% CO2 |
| NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) | DMEM de alta glucosa para expansión rutinaria | 4.5 g/L | Generalmente tolerado | Presente para mantenimiento | Usar solo cuando las condiciones de manejo lo requieran |
Estos son puntos de partida, no reglas permanentes. Vuelva a comprobar morfología, tiempo de duplicación, glucosa del medio usado, lactato y viabilidad después de al menos dos pases en la nueva formulación.
Cómo mitigar
Si el cultivo está creciendo pero el ensayo es inestable, cambie solo una variable de DMEM a la vez. Un cambio completo de alta glucosa, phenol red presente, L-glutamine libre y pyruvate presente a un medio sin colorante, tamponado con HEPES y sin pyruvate puede crear cuatro factores de confusión a la vez.
- Células sensibles a pyruvate: pida DMEM sin pyruvate y luego añada sodium pyruvate a 0.5 o 1.0 mM solo en el brazo de comparación.
- Aplicaciones de imagen sin colorante: elija DMEM sin phenol red y verifique el fondo en el conjunto exacto de filtros. Para reporteros verdes débiles, esto puede importar más que la elección de glucosa.
- Incubación con bajo CO2 o manejo abierto: use 10 a 25 mM HEPES. Confirme el pH después de 60 minutos fuera de la incubadora, con un objetivo de 7.1 a 7.4.
- Ventanas de cultivo más largas: use glutamine estable cuando la corrida exceda 72 horas o cuando aparezca pérdida de viabilidad sensible al amoníaco.
- Protocolos heredados: haga coincidir la modificación ATCC o el conjunto estándar de aminoácidos antes de ajustar suplementos.
Al cambiar de DMEM de baja glucosa a alta glucosa, ejecute una adaptación de dos pases. Para MRC-5 (ATCC CCL-171), un cambio osmótico y nutricional repentino puede cambiar la morfología antes de cambiar la viabilidad.
Ejemplo desarrollado
Un laboratorio quiere un solo DMEM para transfección transitoria de HEK293T (ATCC CRL-3216) e imagen de células vivas de U-2 OS (ATCC HTB-96). El primer instinto es DMEM de alta glucosa con phenol red, L-glutamine y sodium pyruvate porque soporta el crecimiento. Eso no será ideal para imagen.
Divida la elección en dos medios. Para expansión y transfección de HEK293T, comience con DMEM de alta glucosa, 4.5 g/L de glucosa, glutamine estable, phenol red presente y pyruvate a 1.0 mM. Los controles de liberación deben mostrar pH alrededor de 7.2, osmolalidad cerca de 300 a 315 mOsmol/kg, endotoxina ≤0.25 EU/mL y mycoplasma no detectado por qPCR.
Para imagen de U-2 OS, elija DMEM de alta glucosa sin phenol red, añada 10 a 25 mM HEPES si la placa permanece fuera de 5% CO2 y omita pyruvate salvo que la biología lo necesite. En la corrida de cualificación, compare la confluencia a 48 horas, la morfología y el fondo de fluorescencia. Conserve el medio que mantenga al menos 90% de viabilidad y dé el fondo más bajo en el canal del reportero.
Para escalado o cultivo denso, la medición del medio usado es más predictiva que la denominación de catálogo. La literatura de procesos de CHO e hibridomas muestra repetidamente que glucosa, glutamine, lactato y amoníaco deben equilibrarse juntos, no seleccionarse como casillas de verificación separadas [2] Ozturk SS et al. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.
Referencias (numeradas, con DOI)
- Eagle H. Los requisitos específicos de aminoácidos de una cepa celular de mamífero en cultivo tisular. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
- Ozturk SS, Palsson BO. Cinética de crecimiento, metabolismo y producción de anticuerpos en cultivo de células de hibridoma: efectos de la concentración de suero, la concentración de oxígeno disuelto y el pH del medio en un reactor por lotes. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
- Altamirano C, Paredes C, Cairo JJ, Godia F. Mejora de la formulación del medio de cultivo de células CHO: sustitución simultánea de glucosa y glutamine. Biotechnol Prog 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
- Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, et al. Condiciones químicamente definidas para la derivación y el cultivo de iPSC humanas. Stem Cell Reports 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001