MEM alfa (α-MEM) i pożywka minimalna MEM

Harry Eagle opublikował pożywkę minimalną w 1959 roku w Science, po kilku latach systematycznego ustalania, czego komórka ssacza rzeczywiście potrzebuje w hodowli. MEM jest celowo minimalna: trzynaście aminokwasów egzogennych, osiem witamin, glukoza i sześć soli nieorganicznych zrównoważonego roztworu soli Earle'a (chlorek wapnia, chlorek potasu, siarczan magnezu, chlorek sodu, fosforan sodu i wodorowęglan sodu). Nic więcej. O to właśnie chodziło — minimalizm uczynił z MEM zdefiniowany punkt odniesienia, względem którego można badać wymagania dowolnego typu komórek.

α-MEM to „modyfikacja alfa”, opublikowana w 1971 roku przez Clifforda Stannersa, Geralda Eliceiriego i Howarda Greena podczas prac nad rybosomami w mysio-chomiczych komórkach hybrydowych. Potrzebowali oni bogatszej pożywki, która utrzyma komórki hybrydowe i wymagające, bez przechodzenia na bardzo wysokie stężenia aminokwasów typowe dla DMEM. Ich modyfikacja pozostawiła bazę solną i glukozę MEM dokładnie takimi, jakie były, i dodała składniki odżywcze:

• Wszystkie aminokwasy endogenne — alanina, asparagina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, glicyna, prolina i seryna, a także cysteina
• Pirogronian sodu w stężeniu 110 mg/L (1 mM)
• Kwas askorbinowy (witamina C) 50 mg/L, biotyna 0.1 mg/L, witamina B12 około 1.3 mg/L
• Kwas liponowy 0.2 mg/L
• Opcjonalnie rybonukleozydy i deoksyrybonukleozydy

Powstała pożywka jest odżywczo znacznie bogatsza od MEM, ale dzieli z nią skład jonowy i wymagania co do CO2 — i właśnie dlatego α-MEM zachowuje się inaczej niż DMEM, mimo że obie bywają nazywane „wzbogaconą MEM”.

To standardowa formulacja MEM ze zrównoważonymi solami Earle'a — pożywka sprzedawana jako „MEM”, „EMEM” lub „MEM Eagle” bez dalszych dopisków.

Sole nieorganiczne i pozostałe składniki

Aminokwasy (mg/L) — wyłącznie trzynaście aminokwasów egzogennych

L-arginina·HCl 126; L-cystyna·2HCl 31; L-histydyna·HCl·H2O 42; L-izoleucyna 52; L-leucyna 52; L-lizyna·HCl 73; L-metionina 15; L-fenyloalanina 32; L-treonina 48; L-tryptofan 10; L-tyrozyna (jako sól disodowa dwuwodna) 52; L-walina 46; oraz L-glutamina 292.

Witaminy (mg/L) — osiem

Chlorek choliny 1; D-pantotenian wapnia 1; kwas foliowy 1; niacynamid 1; pirydoksal·HCl 1; tiamina·HCl 1; i-inozytol 2; ryboflawina 0.1.

To cała pożywka. MEM nie zawiera żadnych aminokwasów endogennych, nukleozydów, pirogronianu, askorbinianu, biotyny, witaminy B12, kwasu liponowego ani pierwiastków śladowych. Ten minimalizm jest zamierzony — Eagle chciał ustalić, czego komórka ssacza wymaga w minimalnym zakresie, a wszystko poza tym miało pochodzić z surowicy. Z tego samego powodu MEM pozostaje dziś użyteczna w wirusologii, produkcji szczepionek i badaniach zapotrzebowania na składniki odżywcze, gdzie dodatkowe komponenty zakłócałyby wynik.

Istnieje też wersja MEM ze zrównoważonymi solami Hanksa, identyczna poza tym, że zawartość wodorowęglanu sodu spada do około 350 mg/L, co pozwala pracować przy atmosferycznym stężeniu CO2 (patrz rozdział o solach poniżej). Dwa dalsze częste warianty to MEM z dodanymi już aminokwasami endogennymi oraz 2x MEM do nakładek w testach łysinkowych.

Standardowa formulacja α-MEM (z nukleozydami; wersja bez nukleozydów jest identyczna, pomniejszona o osiem nukleozydów):

Sole nieorganiczne i pozostałe składniki

Aminokwasy (mg/L)

L-alanina 25; L-arginina·HCl 126; L-asparagina·H2O 50; kwas L-asparaginowy 30; L-cysteina·HCl·H2O 100; L-cystyna·2HCl 31; kwas L-glutaminowy 75; glicyna 50; L-histydyna·HCl·H2O 42; L-izoleucyna 52; L-leucyna 52; L-lizyna·HCl 73; L-metionina 15; L-fenyloalanina 32; L-prolina 40; L-seryna 25; L-treonina 48; L-tryptofan 10; L-tyrozyna (jako sól disodowa dwuwodna) 52; L-walina 46.

Witaminy (mg/L)

Kwas askorbinowy 50; i-inozytol 2; chlorek choliny 1; D-pantotenian wapnia 1; kwas foliowy 1; niacynamid 1; pirydoksal·HCl 1; tiamina·HCl 1; ryboflawina 0.1; biotyna 0.1; witamina B12 ~1.3.

Nukleozydy (mg/L, w wersji z nukleozydami)

Adenozyna 10; cytydyna 10; guanozyna 10; urydyna 10; tymidyna 10; 2'-deoksyadenozyna 10; 2'-deoksyguanozyna 10; 2'-deoksycytydyna·HCl 11.

Warto zapamiętać dwa kontrasty względem DMEM. α-MEM ma czterokrotnie mniej glukozy (1,000 wobec 4,500 mg/L) i wyraźnie mniej wodorowęglanu (2,200 wobec 3,700 mg/L, czyli 5% CO2 zamiast 10%). Ma za to szerszy zestaw składników odżywczych — askorbinian, biotynę, B12, kwas liponowy i pełny panel aminokwasów endogennych — z których DMEM nie zawiera żadnego. α-MEM nie jest słabszą DMEM; to inny projekt.

To najbardziej brzemienny w skutki wybór przy zamawianiu α-MEM, a pomyłka po cichu psuje eksperymenty selekcyjne.

Komórki syntetyzują nukleotydy dwiema drogami: szlakiem de novo, który buduje puryny i pirymidyny od podstaw i zależy od reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) oraz syntazy tymidylanowej, i szlakiem odzysku, który wykorzystuje ponownie gotowe nukleozydy przy udziale enzymów takich jak HGPRT i kinaza tymidynowa. Nukleozydy obecne w pożywce zasilają szlak odzysku.

α-MEM bez nukleozydów stosuje się wtedy, gdy szlak odzysku musi być zablokowany albo gdy markerem selekcyjnym jest synteza de novo:

• Selekcja oparta na DHFR w liniach CHO-DXB11 i CHO-DG44. Linie te mają niedobór DHFR i nie potrafią syntetyzować nukleotydów de novo. Przeżywają wyłącznie wtedy, gdy dostarczy się im nukleozydy — dlatego α-MEM bez nukleozydów jest dokładnie tą presją selekcyjną, która wyławia komórki z przyjętym wektorem ekspresyjnym niosącym DHFR. Podanie nukleozydów całkowicie niweczy selekcję. To klasyczne zastosowanie i powód, dla którego α-MEM bez nukleozydów jest standardowym odczynnikiem bioprodukcyjnym.
• Amplifikacja metotreksatem. Ta sama logika: metotreksat hamuje DHFR, a nukleozydy w pożywce uratowałyby komórki, przeciwko którym prowadzi się selekcję.
• Selekcja HAT i HT w pracy z hybrydomami, gdzie chodzi o kontrolę nad tym, który szlak jest dostępny.

α-MEM z nukleozydami stosuje się wtedy, gdy potrzebna jest po prostu bogata pożywka: rutynowa ekspansja mezenchymalnych komórek zrębu, hodowla szpiku kostnego, wzrost komórek pierwotnych oraz utrzymywanie linii z niedoborem DHFR przed rozpoczęciem selekcji. Nukleozydy zmniejszają obciążenie metaboliczne związane z syntezą nukleotydów i na ogół poprawiają wzrost wymagających komórek pierwotnych.

Jeśli protokół w ogóle nie wspomina o nukleozydach, a selekcji się nie prowadzi, bezpieczniejszym domyślnym wyborem jest wersja z nukleozydami. Jeśli protokół dotyczy DHFR, metotreksatu, HAT lub HT, trzeba go przeczytać uważnie — odpowiedzią jest zwykle „bez nukleozydów”, a oba produkty bywają mylone, bo ich nazwy katalogowe różnią się jednym słowem.

MEM dostarczana jest na dwóch różnych bazach solnych, a różnica dotyczy wyłącznie tego, gdzie zamierza się trzymać hodowlę.

MEM ze zrównoważonymi solami Earle'a zawiera 2,200 mg/L wodorowęglanu sodu i jest przeznaczona do inkubatora z 5% CO2. To standardowa postać laboratoryjna i to właśnie oznacza „MEM” bez dalszych dopisków. α-MEM korzysta z tej bazy.

MEM ze zrównoważonymi solami Hanksa zawiera tylko około 350 mg/L wodorowęglanu sodu i jest przeznaczona do naczyń zamkniętych szczelnie lub do pracy przy atmosferycznym CO2 — historycznie do transportu tkanek, do hodowli w zamkniętych butelkach i do procedur wykonywanych na otwartym stole. Umieszczenie MEM na solach Hanksa w inkubatorze z 5% CO2, w butelce z wentylowanym korkiem, sprawi, że pH spadnie poniżej pojemności buforowej.

Zasada wykracza poza MEM: stężenie wodorowęglanu i stężenie CO2 w inkubatorze to dobrana para, ponieważ pH w tych pożywkach wyznacza stosunek wodorowęglanu do rozpuszczonego CO2. Widząc na karcie produktu nieoczekiwanie niską wartość wodorowęglanu, należy najpierw sprawdzić, czy produkt nie jest formulacją na solach Hanksa albo przeznaczoną do naczyń zamkniętych, zanim trafi do inkubatora.

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC). α-MEM jest standardową bazą do namnażania ludzkich i zwierzęcych MSC ze szpiku kostnego oraz z tkanki tłuszczowej, zwykle z 10–20% FBS lub ze zdefiniowanym suplementem. Niska zawartość glukozy jest tu zaletą — duże stężenie glukozy ma udokumentowany wpływ na proliferację i potencjał różnicowania MSC.

Hodowle kostne i krwiotwórcze. Osteoblasty, testy różnicowania osteoklastów, zrębowe hodowle szpiku i długoterminowe hodowle szpikowe prowadzi się zwyczajowo w α-MEM. Zawartość askorbinianu ma bezpośrednie znaczenie w pracy z osteoblastami, ponieważ askorbinian jest niezbędny do hydroksylacji kolagenu i odkładania macierzy.

CHO-DXB11 i CHO-DG44. Jak opisano wyżej, α-MEM z nukleozydami i bez nich to standardowa para do selekcji opartej na DHFR i do amplifikacji metotreksatem w tych liniach produkcyjnych.

Komórki pierwotne w ogólności. Chondrocyty, komórki miazgi zęba, warstwy odżywcze dla keratynocytów, pierwotne fibroblasty i wiele innych hodowli pierwotnych radzi sobie lepiej w α-MEM niż w zwykłej MEM — dzięki aminokwasom endogennym, pirogronianowi, askorbinianowi i nukleozydom.

Zwykła MEM pozostaje w użyciu tam, gdzie potrzebna jest minimalna, dobrze zdefiniowana baza — w wirusologii i produkcji szczepionek na komórkach Vero i MRC-5, w testach łysinkowych oraz w badaniach zapotrzebowania na składniki odżywcze, gdzie dodatkowe komponenty zakłócałyby wynik.

Warto zwrócić uwagę na wapń: α-MEM zawiera 1.8 mM, tyle samo co DMEM. Odpowiada to hodowlom adherentnym i różnicującym się, ale czyni ją słabą bazą dla protokołów keratynocytowych wymagających małego stężenia wapnia.

CO2. Zawartość wodorowęglanu w α-MEM — 2,200 mg/L (26 mM) — jest dobrana do 5% CO2. To standardowe ustawienie inkubatora, więc α-MEM utrzymuje pH bardziej przewidywalnie prosto z butelki niż DMEM.

Glutamina. 2 mM (292 mg/L) w formulacjach zawierających glutaminę. Rozkłada się ona w roztworze do amoniaku, więc pożywka bez glutaminy z dodatkiem świeżej glutaminy albo stabilny dipeptyd L-alanylo-L-glutamina dają bardziej powtarzalną hodowlę długoterminową — co ma szczególne znaczenie przy namnażaniu MSC, gdzie hodowle trwają tygodniami.

Surowica. Typowo 10% FBS; protokoły MSC często wskazują 15–20%, a do zastosowań klasy klinicznej coraz częściej suplement zdefiniowany albo lizat płytek krwi ludzkiej.

Stabilność askorbinianu. 50 mg/L kwasu askorbinowego w α-MEM jest naprawdę użyteczne, ale i naprawdę nietrwałe — związek utlenia się w roztworze w ciągu dni do tygodni. Przy różnicowaniu osteogennym, gdzie askorbinian napędza odkładanie kolagenu, należy suplementować świeżym askorbinianem-2-fosforanem, zamiast polegać na tym, co zostało w butelce otwartej przed miesiącem. Askorbinian-2-fosforan to właśnie z tego powodu stabilizowana forma stosowana w protokołach różnicowania.

Przechowywanie. 2–8 °C bez dostępu światła, zwykle 12–24 miesiące w nieotwartym opakowaniu. Po dodaniu glutaminy — około czterech tygodni. α-MEM jest bardziej wrażliwa na światło niż zwykła MEM, ponieważ askorbinian, ryboflawina i folian ulegają fotodegradacji. Należy trzymać ją w zamkniętej lodówce.

Sproszkowana α-MEM dostarczana jest bez wodorowęglanu sodu; przy rekonstytucji dodaje się 2.2 g/L, ustawia pH o około 0.2 jednostki poniżej wartości docelowej, aby uwzględnić wzrost podczas sączenia, i sterylizuje przez sączenie na filtrze 0.22 µm.

Zamówienie niewłaściwej wersji nukleozydowej. Oba produkty różnią się w nazwie katalogowej jednym słowem, a całkowicie — zachowaniem pod selekcją DHFR lub metotreksatem. Należy sprawdzić kartę produktu, a nie etykietę na półce.

Zakładanie, że α-MEM to DMEM o niskiej zawartości glukozy. Nie jest. Inna zawartość wodorowęglanu (2,200 wobec 3,700 mg/L), inne wymagania co do CO2, inny zestaw witamin, a do tego nukleozydy, askorbinian, kwas liponowy i pirogronian, których DMEM nie ma.

Poleganie na askorbinianie z butelki w eksperymentach różnicowania. Kwas askorbinowy w roztworze ulega rozkładowi. Do prac osteogennych należy stosować askorbinian-2-fosforan jako świeży suplement.

Umieszczenie MEM na solach Hanksa w inkubatorze CO2. Jej 350 mg/L wodorowęglanu nie zbuforuje pożywki przy 5% CO2 i hodowla ulegnie zakwaszeniu.

Przenoszenie hodowli MSC między α-MEM a DMEM w trakcie badania. Zmienia się zawartość glukozy, wapnia i mikroskładników; wraz z nimi przesuwa się tempo proliferacji i potencjał różnicowania.