Jak wybrać DMEM dla swojej linii komórkowej
Run transfekcji HEK293T może wyglądać prawidłowo po 24 godzinach, a mimo to nie osiągnąć oczekiwanego uzysku po 72 godzinach, jeśli wybór DMEM jest niewłaściwy. Typowy podział to high glucose, 4.5 g/L, kontra low glucose, 1.0 g/L, ale phenol red, pyruvate, HEPES oraz chemia glutamine często mają równie duże znaczenie. Ten przewodnik zaczyna od praktycznych zasad wyboru, a następnie pokazuje mierzone kontrole QC, takie jak pH 7.21, osmolality 312 mOsmol/kg oraz viability HEK293T 96.3% po 96 godzinach.
Problem (z konkretnym przykładem)
Typowy przypadek: HEK293T (ATCC CRL-3216) dobrze rośnie w high-glucose DMEM podczas rutynowego pasażowania, a następnie spada z 92% do 78% viability po zmianie odczynnika, która niepostrzeżenie usunęła sodium pyruvate i przełączyła stable glutamine na free L-glutamine.
To nie jest tajemnicza awaria linii komórkowej. To niedopasowanie formulacji.
Wybór DMEM zwykle rozstrzyga się w sześciu wymiarach: poziom glucose, phenol red, forma L-glutamine, sodium pyruvate, HEPES oraz zestaw amino acid. High glucose, 4.5 g/L, wspiera szybko glikolityczne linie i gęste hodowle. Low glucose, 1.0 g/L, często jest lepszym punktem wyjścia, gdy komórki wykazują akumulację lactate, zmienioną morfologię lub odczyty wrażliwe na metabolizm.
- Glucose: 4.5 g/L dla HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96) oraz wielu workflow o wysokiej gęstości. 1.0 g/L do wolniejszych badań typu primary-like lub wrażliwych na metabolizm.
- Phenol red: zachowaj go do rutynowej hodowli i wizualnej oceny dryfu pH. Usuń go do obrazowania fluorescencyjnego, testów wrażliwych na hormony lub słabych odczytów reporterowych.
- L-glutamine: free L-glutamine jest konwencjonalna, ale stable glutamine dipeptide ogranicza wzrost ammonia podczas dłuższego zasilania.
- Sodium pyruvate: przydatny w 1.0 mM do buforowania stresu oksydacyjnego i regeneracji. Pomiń go, gdy pyruvate wpływa na testy strumienia metabolicznego.
- HEPES: przydatny w 10 do 25 mM do obsługi przy low-CO2, mikroskopii oraz okresów transportu poza inkubatorem 5% CO2.
- Zestaw amino acid: standardowy DMEM nadaje się do rutynowego utrzymania, modyfikacja ATCC pomaga dopasować protokoły starszych banków komórek, a zaawansowane zestawy amino acid wspierają hodowle o większej gęstości lub podatne na stres.
Mechanizm (rysunek 1, rysunek 2)
Rysunek 1, presja glucose i lactate. High-glucose DMEM zaczyna od 4.5 g/L glucose, co daje szybko rosnącym komórkom większą rezerwę węgla. Kompromisem jest powstawanie lactate. W gęstych hodowlach HEK293T (ATCC CRL-3216) lub HeLa (ATCC CCL-2), lactate powyżej 20 do 25 mM często zbiega się z wolniejszym wzrostem, dryfem pH poniżej 7.0 i wcześniejszym wyczerpaniem pożywki.
Rysunek 2, chemia buforu i azotu. DMEM buforowany bicarbonate jest projektowany wokół kontroli CO2. HEPES dodaje pojemność buforową podczas pracy na stole lub obrazowania żywych komórek, gdy naczynie może pozostawać w powietrzu atmosferycznym przez 30 do 90 minut. Chemia glutamine ma znaczenie, ponieważ free L-glutamine rozkłada się podczas przechowywania i hodowli, podczas gdy stable glutamine może zmniejszać obciążenie ammonia w runach 72 do 120 hour.
Pyruvate znajduje się w innym punkcie decyzyjnym. Może wspierać regenerację po stresie oksydacyjnym i daje komórkom dodatkowe źródło węgla, ale może również maskować fenotypy mitochondrialne. Do testów metabolicznych typu Seahorse, śledzenia lactate lub badań odpowiedzi na pyruvate zacznij od pyruvate-free DMEM i dodawaj pyruvate jako kontrolowaną zmienną.
Logika bazowa jest stara, ale nadal użyteczna. Prace Eagle’a nad zdefiniowanymi składnikami odżywczymi ustaliły, dlaczego amino acids, vitamins, salts i glucose należy traktować jako aktywne zmienne eksperymentalne, a nie składniki tła [1] Eagle H. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.
Metody pomiaru
Nie wybieraj DMEM wyłącznie na podstawie nazwy. Potwierdź zmierzone wartości serii, a następnie dopasuj je do linii komórkowej i testu.
| Pomiar | Typowa wartość zwolnienia | Zakres akceptacji | Dlaczego to ma znaczenie |
|---|---|---|---|
| pH w 20 do 25°C | 7.21 | 7.0 do 7.4 | Wykrywa niedopasowanie CO2 i buforu przed rozpoczęciem hodowli |
| Osmolality | 312 mOsmol/kg | 260 do 320 mOsmol/kg | Wysokie wartości stresują MDCK (ATCC CCL-34) i MRC-5 (ATCC CCL-171) |
| Endotoxin, LAL | ≤0.25 EU/mL | ≤0.50 EU/mL | Ważne dla odczytów zapalnych i nabłonkowych |
| Mycoplasma, qPCR | Niewykryte | Niewykryte | Chroni dane dotyczące tempa wzrostu i transkryptomiki |
| Sterility | USP <71> pozytywnie | Brak wzrostu | Wymagane do zwolnienia do rutynowej hodowli |
| Promocja wzrostu | HEK293T 96.3% viability po 96 h | ≥90.0% viability | Sprawdza, czy formulacja wspiera wrażliwą, szybko rosnącą linię |
Przy wyborze glucose zmierz zużytą pożywkę po 48 i 72 godzinach. Jeśli glucose pozostaje powyżej 1.5 g/L, ale lactate przekracza 22 mM, zmiana na jeszcze wyższą gęstość składników odżywczych rzadko jest odpowiedzią. Jeśli glucose spada poniżej 0.5 g/L, podczas gdy viability pozostaje powyżej 90%, strategia high-glucose lub zasilana jest bardziej uzasadniona.
Progi tolerancji według typu komórek (tabela)
| Linia komórkowa | Typowy punkt wyjścia DMEM | Preferencja glucose | Pyruvate | Phenol red | Uwaga dotycząca HEPES |
|---|---|---|---|---|---|
| HEK293T (ATCC CRL-3216) | High-glucose DMEM z L-glutamine | 4.5 g/L | Opcjonalny, często 1.0 mM do regeneracji | Obecny do rutynowego pasażowania, nieobecny do obrazowania | 10 do 25 mM, jeśli płytki opuszczają CO2 na czas obsługi transfekcji |
| HeLa (ATCC CCL-2) | High-glucose DMEM, standardowe amino acids | 4.5 g/L | Zwykle tolerowany | Usuń do fluorescencji lub prac wrażliwych na estrogen | Przydatny podczas sesji mikroskopowych dłuższych niż 30 min |
| MRC-5 (ATCC CCL-171) | Low-glucose DMEM lub dopasowana starsza modyfikacja | 1.0 g/L | Stosuj ostrożnie, jeśli monitorowane są markery senescence | Obecny do rutynowej hodowli fibroblastów | Unikaj nadmiaru buforu, chyba że potrzebna jest obsługa low-CO2 |
| Vero (ATCC CCL-81) | High-glucose DMEM do ekspansji | 4.5 g/L | Często pomocny podczas regeneracji po rozmrożeniu | Obecny, chyba że punkt końcowy obrazowania wymaga braku barwnika | Dobry do transportu i przygotowania infekcji poza inkubatorem |
| MDCK (ATCC CCL-34) | Low to moderate glucose DMEM, ścisła kontrola osmolality | 1.0 g/L najpierw, potem optymalizacja | Zależny od testu | Usuń do obrazowania bariery | Stosuj, gdy praca na otwartej płytce przekracza 45 min |
| HepG2 (ATCC HB-8065) | High-glucose DMEM z pyruvate | 4.5 g/L | Zwykle 1.0 mM | Nieobecny do metabolicznych testów fluorescencyjnych | Przydatny, ponieważ testy wątrobowe często obejmują długą obsługę |
| U-2 OS (ATCC HTB-96) | High-glucose DMEM, opcja imaging-grade | 4.5 g/L | Opcjonalny | Nieobecny do fluorescencji żywych komórek | Zalecany do obrazowania time-lapse poza 5% CO2 |
| NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) | High-glucose DMEM do rutynowej ekspansji | 4.5 g/L | Zwykle tolerowany | Obecny do utrzymania | Stosuj tylko wtedy, gdy wymagają tego warunki obsługi |
To są punkty wyjścia, a nie stałe reguły. Ponownie sprawdź morfologię, czas podwojenia, zużytą glucose, lactate i viability po co najmniej dwóch pasażach w nowej formulacji.
Jak ograniczyć problem
Jeśli hodowla rośnie, ale test jest niestabilny, zmieniaj tylko jedną zmienną DMEM naraz. Pełne przejście z high glucose, obecnym phenol red, free L-glutamine i obecnym pyruvate na pożywkę bez barwnika, buforowaną HEPES i pyruvate-free może utworzyć cztery czynniki zakłócające jednocześnie.
- Komórki wrażliwe na pyruvate: zamów pyruvate-free DMEM, a następnie dodaj sodium pyruvate w 0.5 lub 1.0 mM tylko w ramieniu porównawczym.
- Zastosowania obrazowania bez barwnika: wybierz phenol red-free DMEM i zweryfikuj tło w dokładnym zestawie filtrów. Dla słabych zielonych reporterów może to mieć większe znaczenie niż wybór glucose.
- Inkubacja low-CO2 lub otwarta obsługa: użyj 10 do 25 mM HEPES. Potwierdź pH po 60 minutach poza inkubatorem, z celem 7.1 do 7.4.
- Dłuższe okna hodowli: użyj stable glutamine, gdy run przekracza 72 hours lub gdy pojawia się utrata viability wrażliwa na ammonia.
- Starsze protokoły: dopasuj modyfikację ATCC lub standardowy zestaw amino acid przed dostosowaniem suplementów.
Przy przejściu z low-glucose na high-glucose DMEM wykonaj adaptację przez dwa pasaże. Dla MRC-5 (ATCC CCL-171) nagła zmiana osmotyczna i odżywcza może zmienić morfologię, zanim zmieni viability.
Przykład roboczy
Laboratorium chce jeden DMEM do przejściowej transfekcji HEK293T (ATCC CRL-3216) i obrazowania żywych komórek U-2 OS (ATCC HTB-96). Pierwszy odruch to high-glucose DMEM z phenol red, L-glutamine i sodium pyruvate, ponieważ wspiera wzrost. To nie będzie idealne do obrazowania.
Podziel wybór na dwie pożywki. Do ekspansji i transfekcji HEK293T zacznij od high-glucose DMEM, 4.5 g/L glucose, stable glutamine, obecnego phenol red oraz pyruvate w 1.0 mM. Kontrole zwolnienia powinny wykazać pH około 7.2, osmolality blisko 300 do 315 mOsmol/kg, endotoxin ≤0.25 EU/mL oraz mycoplasma niewykrytą metodą qPCR.
Do obrazowania U-2 OS wybierz high-glucose DMEM bez phenol red, dodaj 10 do 25 mM HEPES, jeśli płytka pozostaje poza 5% CO2, i pomiń pyruvate, chyba że wymaga tego biologia. W runie kwalifikacyjnym porównaj 48-godzinną konfluencję, morfologię i tło fluorescencji. Zachowaj pożywkę, która utrzymuje co najmniej 90% viability i daje niższe tło w kanale reporterowym.
Przy skalowaniu lub gęstej hodowli pomiar zużytej pożywki jest bardziej predykcyjny niż nazewnictwo katalogowe. Literatura procesowa CHO i hybridoma wielokrotnie pokazuje, że glucose, glutamine, lactate i ammonia muszą być równoważone łącznie, a nie wybierane jako osobne pola wyboru [2] Ozturk SS et al. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.
Piśmiennictwo (numerowane, z DOI)
- Eagle H. The specific amino acid requirements of a mammalian cell strain in tissue culture. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
- Ozturk SS, Palsson BO. Growth, metabolic, and antibody production kinetics of hybridoma cell culture: effects of serum concentration, dissolved oxygen concentration, and medium pH in a batch reactor. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
- Altamirano C, Paredes C, Cairo JJ, Godia F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnol Prog 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
- Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Stem Cell Reports 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001