細胞培養のコンタミネーション（汚染）

細胞培養のコンタミネーションは2つのグループに分けて考える価値があります。求められる行動がまったく違うからです。

見えるグループ — 細菌、酵母、糸状菌 — は速く増え、培地を変え、1〜5日のうちに明らかになります。これらは見れば分かります。厄介ではありますが自ら名乗り出てくれるので、有用な問いは「これは何か」ではなく「どこから入ったか」です。答えはほぼ必ず、無菌操作の特定の、そして直せる破綻だからです。

見えないグループ — マイコプラズマ、ウイルス、そして取り違えられた細胞株による交差汚染 — は濁りも色の変化も起こさず、目で見える手がかりを何も残しません。これらは意図した検査でしか見つからず、しかも静かであるぶん結果への被害はずっと大きくなります。取り違えられた株やマイコプラズマ陽性の株は、見た目にはきれいで再現性のあるデータを出し続けます。ただし、それは対象を取り違えたデータです。

7つ目として挙げておくべきものがあります。化学的なコンタミネーション — エンドトキシン、洗剤の残留、チューブから溶け出した可塑剤、金属イオン、規格を外れた培地成分です。生物ではなく、目にも見えず、そして「細胞の機嫌が悪い」ともっともよく片付けられてしまう症状 — 増殖の遅れ、接着不良、コンフルエントに達しないこと — をそのまま引き起こします。

見え方。 培地が白濁します。通常は原因となった操作から 24–72 時間以内です。フェノールレッド入りの培地では、好気性あるいは通性の菌が大量に増えると pH が下がり、赤橙色から黄色へ変わります。位相差 200–400× では、細菌は非常に小さい桿菌、球菌、球桿菌として見えます。太さはおよそ 0.5–1 µm、長いもので 20 µm ほどになり、細胞のあいだをブラウン運動で、運動性の種では方向をもって移動します。昨日までなかったきらきらした顆粒状の背景が、典型的な最初のサインです。

よくある原因。 操作者の手技 — 手、袖、開けた容器の上で話すこと、開いたフラスコの上を未滅菌の物が通ること。汚染された水浴やインキュベーターの水皿。濾過していない、あるいは正しく濾過していない添加液。複数の株にまたがって使った汚染ボトル。

対処。 廃棄します。容器は安全キャビネットから出す前にオートクレーブするか消毒してください。細菌に汚染されたフラスコを抗生物質で救おうとしてはいけません。目に見える増殖が抑えられても、低レベルの生き残りとそのエンドトキシンは残り、目に見える問題を目に見えない問題に変えただけになります。

見え方。 酵母は顕微鏡下で、輪郭のはっきりした卵形または球形の粒子として見えます。大きさは通常 3–5 µm で細菌よりはっきり大きく、しばしば出芽している姿が見えます — 大きな母細胞に小さな娘細胞が付いた形です。出芽は識別にもっとも役立つ特徴です。

培地は濁りますが、細菌より遅く、コンタミネーションがかなり進んでからのことが多くなります。pH の挙動は特徴的で、覚えておく価値があります。酵母は汚染が重くなるまで pH をほとんど変えず、重くなった時点で通常は pH が上がります — 下がるのではありません。濁っているのにフェノールレッドが黄色ではなくピンクから紫に寄っている培養は、細菌より酵母である可能性が高いといえます。

よくある原因。 空気由来です。酵母は一般環境に豊富にいるため、気流が損なわれた安全キャビネット、手入れの悪い HEPA フィルター、キャビネット外での作業が通常の説明になります。皮膚と毛髪。汚染された水浴。

対処。 廃棄します。そのうえで安全キャビネットを確認してください。気流を認証し、フィルターを点検し、サッシの高さを誤って作業している人がいないかを確かめます。

見え方。 糸状菌はあらゆるコンタミネーションの中でもっとも見た目にはっきりしています。顕微鏡下では、菌糸が細く綿のように分岐した繊維として視野を横切り、ときに胞子の密な塊を伴います。肉眼では、白、黄、灰、黒の小さな綿毛状の点として始まり、培地に浮くかフラスコ壁の液面に付着し、数日のうちに大きな毛羽立った塊へ育ちます。培地は細菌のときより長く澄んだままのことが多く、進行につれて pH がわずかに上がることもあります。

フラスコの中で「糸を引く」「綿くずのよう」と表現されるものは、ほぼ必ず糸状菌です。

よくある原因。 空気中の胞子です。真菌の胞子は丈夫でどこにでもあり、表面で長く生き残ります。建物の工事、湿気、手入れの悪いインキュベーター（水皿は典型的な温床です）、汚染された棚板。培養室に持ち込んだ段ボールは、見落とされがちな発生源です。

対処。 廃棄し、フラスコ1本の問題ではなくインキュベーター全体の事故として扱ってください。インキュベーターを空にし、棚板と水皿を取り出してオートクレーブし、除染サイクルを回すか承認された殺胞子剤で拭き上げ、水皿は承認された防カビ処理剤を入れた新しい滅菌水に入れ替えます。インキュベーターに定着した真菌の胞子は、インキュベーター自体を清浄にするまで新しい培養に感染し続けます。

見え方。 ありません。そこがこの問題のすべてです。マイコプラズマは 10⁷–10⁸ 個/mL に達しても濁りを生じず、目に見える pH の変化もなく、通常の倒立顕微鏡では何も検出できません。0.3–0.8 µm で細胞壁を持たないため 0.2 µm のフィルターを通過し、本質的にペニシリンが効きません。

間接的な兆候は非特異的で、いくらでも言い訳がついてしまいます。増殖が徐々に遅くなる、飽和密度が下がる、培地の消費が想定より速い、トランスフェクション効率が落ちる、薬剤応答がずれていく。いずれも、血清のロットを替えるのではなく検査を行うきっかけにすべきものです。

よくある原因。 同じ研究室にある汚染された他の培養から、エアロゾルや共用ボトルを介して広がります。汚染種のいくつかはヒトの口腔常在菌であるため、実験者自身も原因になります。動物由来の血清とトリプシンは歴史的に重要でしたが、現在はかなり減りました。そして、公的なバンク以外から入ってくる細胞株です。

対処。 別の方法で確認し、隔離し、通常は廃棄します。清浄な凍結ストックからやり直すほうが、除去処理より速く、説明もつきます。検出法の詳しい比較、検査の頻度、除去と廃棄の判断は、マイコプラズマ検査のリファレンスページで扱っています。

見え方。 産生している培養では、通常は何も見えません。多くのウイルスは細胞変性効果を示さずに宿主細胞株の中で増えるため、培養は見た目も増え方も正常です。細胞変性効果が出る場合は、単層の中で細胞の円形化、剥離、合胞体の形成、プラーク様の抜けとして現れますが、いずれも過剰なコンフルエンシーや失敗したトリプシン処理と取り違えやすいものです。

なぜ重要か。 日常の研究用培養でウイルスのコンタミネーションが問題になることはまれですが、バイオ医薬品や細胞治療の製造へ向かう材料では深刻な問題であり、原材料がヒトや霊長類に由来する場合は実験室のバイオセーフティ上の考慮事項にもなります。

よくある原因。 もとの組織やドナー材料。動物由来の原材料、主に血清とトリプシン。そして施設内の他の培養です。

対処。 ウイルス検査は専門的な作業です。特定の因子を狙った PCR パネル、広く網をかけるなら指標細胞株を用いた in vitro 外来性因子試験を行います。日常の研究では予防が現実的な管理策です。ウイルススクリーニングのデータを公開している供給元の血清とトリプシンを使うか、動物由来成分不含（ADCF）の試薬と組換え剥離酵素を使えば、経路そのものがなくなります。

細胞生物学でもっとも影響の大きいコンタミネーションは、そもそも生物ではありません。ある細胞株が別の細胞株を覆い尽くすこと、あるいはどこかの時点でラベルを取り違えられることです。

大規模な認証調査では、実際に使われている細胞株の無視できない割合がラベルどおりのものではないと、繰り返し報告されてきました。HeLa がもっとも有名な犯人です — 増殖が速く丈夫で、歴史的に多くの株を置き換えてきました。しかし勢いのある株はどれも、混ざればより遅い株を覆い尽くします。

見え方。 ありません。あるいは形態、増殖速度、マーカー発現がゆっくり変化しますが、継代数のせいだと片付けやすい程度です。

原因。 2つの株を同時に安全キャビネットで扱うこと。培地ボトルの共用。ラベルを誤ったバイアル。ずさんな凍結庫の記録。管理履歴の分からない共同研究者から株を受け取ること。

対処と予防。 ショートタンデムリピート（STR）解析がヒト細胞株の標準的な認証法であり、マウス株にはマウス用の STR パネルがあります。受け取ったとき、バンク化するとき、そしてその後も定期的にプロファイルを取ってください。2つの細胞株を同時に安全キャビネットで開けないこと。培地ボトルを株のあいだで共用しないこと。現在ではほとんどの学術誌が STR で確認した同一性の記載を求めており、解析の費用は実験をやり直す費用に比べれば取るに足りません。

おかしく見えるものが、すべて生きているわけではありません。培養を捨てる前に、生物以外の説明を除外してください。

• エンドトキシン — 水、血清、原材料に由来し、免疫応答性のある細胞を活性化して増殖や分化を変えますが、目に見える兆候はありません。熱に安定でオートクレーブでも残り、0.2 µm の濾過では除けません。
• 洗剤や消毒剤の残留 — ガラス器具に残ったもの、あるいは安全キャビネットの表面をすすぎ切れていない場合。
• 可塑剤や溶出物 — チューブ、保存ボトル、組織培養グレードでないプラスチックから溶け出します。
• 析出物 — リン酸カルシウムの結晶、析出した血清タンパク質、低温保存後に結晶化した培地成分などは、顕微鏡下では粒子状のコンタミネーションに見えます。しかし光を強く反射し、幾何学的で、自ら動かず、観察のあいだに増えません。4時間ほど後にもう一度見てください。コンタミネーションは増え、析出物は増えません。
• 細胞の破片やアポトーシス小体 — ストレス下や過剰にコンフルエントな培養から生じ、低倍率では細菌のコンタミネーションに似ます。倍率を上げればたいてい決着します。

労力あたりでどれだけコンタミネーションを防げるか、おおよその順に並べています。

1. 無菌操作と安全キャビネットの規律。 正しいサッシの高さで作業し、手と器材は重要な開口部より下流に置き、開いた容器の上を何も通さず、キャビネットに入れるものはすべて 70% エタノールで拭き、キャビネットに向かって話さないこと。この1項目で大半のコンタミネーションが防げます。
2. 一度に開けるのは1株、ボトルは1株に1本。 交差汚染と、微生物の水平方向の広がりの大半を一挙になくします。
3. 入ってきた培養は隔離する。 検査が済むまで別のインキュベーターに置きます。
4. インキュベーターを維持する。 週1回の水皿交換と承認された処理剤、月1回の拭き上げ、計画的な除染サイクル、そしてメーカー指定の間隔での HEPA フィルター交換。
5. 安全キャビネットを毎年認証し、気流アラームが働くことを確認します。
6. 早くバンクを作り、清浄な状態で作り、そのバンクを検査する。 低い継代数の検査済みマスターバンクがあれば、コンタミネーションは午後半日の手間で済みます。
7. 上記の代わりに予防的な抗生物質を使わない。 低レベルの細菌汚染を隠し、マイコプラズマ、真菌、交差汚染には何もせず、研究室が自分の手技の劣化に気づかなくなります。