Cách chọn DMEM cho dòng tế bào của bạn

Một trường hợp thường gặp: HEK293T (ATCC CRL-3216) tăng trưởng tốt trong DMEM glucose cao khi cấy chuyền định kỳ, sau đó giảm từ tỷ lệ sống 92% xuống 78% sau một thay đổi thuốc thử đã âm thầm loại bỏ sodium pyruvate và chuyển từ glutamine ổn định sang L-glutamine tự do.

Đó không phải là một thất bại bí ẩn của dòng tế bào. Đó là sự không khớp về công thức.

Việc lựa chọn DMEM thường được quyết định theo sáu chiều: mức glucose, phenol red, dạng L-glutamine, sodium pyruvate, HEPES và bộ amino acid. Glucose cao, 4.5 g/L, hỗ trợ các dòng đường phân nhanh và nuôi cấy mật độ cao. Glucose thấp, 1.0 g/L, thường là điểm khởi đầu tốt hơn khi tế bào cho thấy tích lũy lactate, thay đổi hình thái hoặc các chỉ số đọc nhạy cảm với chuyển hóa.

• Glucose: 4.5 g/L cho HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96) và nhiều quy trình mật độ cao. 1.0 g/L cho các nghiên cứu chậm hơn, giống tế bào sơ cấp hoặc nhạy cảm với chuyển hóa.
• Phenol red: giữ lại cho nuôi cấy thường quy và quan sát trực quan trôi pH. Loại bỏ cho chụp ảnh huỳnh quang, xét nghiệm nhạy cảm với hormone hoặc các chỉ số reporter yếu.
• L-glutamine: L-glutamine tự do là quy ước phổ biến, nhưng glutamine dipeptide ổn định làm giảm tăng ammonia trong các lần cấp dinh dưỡng kéo dài hơn.
• Sodium pyruvate: hữu ích ở 1.0 mM để đệm stress oxy hóa và phục hồi. Bỏ qua khi pyruvate ảnh hưởng đến các xét nghiệm dòng chuyển hóa.
• HEPES: hữu ích ở 10 đến 25 mM cho thao tác trong điều kiện CO2 thấp, soi kính hiển vi và các giai đoạn vận chuyển bên ngoài tủ ấm 5% CO2.
• Bộ amino acid: DMEM tiêu chuẩn phù hợp cho duy trì thường quy, biến đổi ATCC giúp khớp với các quy trình ngân hàng tế bào cũ, và các bộ amino acid nâng cao hỗ trợ nuôi cấy mật độ cao hơn hoặc dễ bị stress.

Hình 1, áp lực glucose và lactate. DMEM glucose cao bắt đầu ở 4.5 g/L glucose, cung cấp cho các tế bào tăng trưởng nhanh nhiều dự trữ carbon hơn. Sự đánh đổi là hình thành lactate. Trong nuôi cấy HEK293T (ATCC CRL-3216) hoặc HeLa (ATCC CCL-2) mật độ cao, lactate trên 20 đến 25 mM thường trùng với tăng trưởng chậm hơn, pH trôi xuống dưới 7.0 và môi trường cạn kiệt sớm hơn.

Hình 2, hóa học đệm và nitrogen. DMEM đệm bicarbonate được thiết kế xoay quanh kiểm soát CO2. HEPES bổ sung khả năng đệm trong khi thao tác trên bàn thí nghiệm hoặc chụp ảnh tế bào sống, khi đĩa có thể ở trong không khí phòng trong 30 đến 90 phút. Hóa học glutamine rất quan trọng vì L-glutamine tự do phân hủy trong quá trình bảo quản và nuôi cấy, trong khi glutamine ổn định có thể giảm tải ammonia trong các lần chạy 72 đến 120 giờ.

Pyruvate nằm ở một điểm quyết định khác. Nó có thể hỗ trợ phục hồi sau stress oxy hóa và cung cấp cho tế bào một nguồn carbon bổ sung, nhưng cũng có thể che lấp các kiểu hình ty thể. Đối với các xét nghiệm chuyển hóa kiểu Seahorse, truy vết lactate hoặc nghiên cứu đáp ứng pyruvate, hãy bắt đầu với DMEM không có pyruvate và thêm pyruvate như một biến được kiểm soát.

Logic nền tảng đã cũ nhưng vẫn hữu ích. Công trình dinh dưỡng xác định của Eagle đã thiết lập lý do vì sao amino acid, vitamin, muối và glucose phải được xem là các biến thí nghiệm chủ động thay vì thành phần nền [1] Eagle H. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.

Không chọn DMEM chỉ dựa vào tên. Xác nhận các giá trị lô đã đo, sau đó khớp chúng với dòng tế bào và xét nghiệm.

Đối với lựa chọn glucose, hãy đo môi trường đã sử dụng sau 48 và 72 giờ. Nếu glucose vẫn trên 1.5 g/L nhưng lactate vượt 22 mM, việc chuyển sang mật độ dinh dưỡng cao hơn nữa hiếm khi là câu trả lời. Nếu glucose giảm xuống dưới 0.5 g/L trong khi tỷ lệ sống vẫn trên 90%, chiến lược glucose cao hoặc bổ sung dinh dưỡng sẽ hợp lý hơn.

Đây là các điểm khởi đầu, không phải quy tắc cố định. Kiểm tra lại hình thái, thời gian nhân đôi, glucose đã tiêu thụ, lactate và khả năng sống sau ít nhất hai lần cấy chuyền trong công thức mới.

Nếu nuôi cấy đang tăng trưởng nhưng phép thử không ổn định, chỉ thay đổi một biến số DMEM tại một thời điểm. Việc chuyển hoàn toàn từ glucose cao, có phenol red, L-glutamine tự do và có pyruvate sang môi trường không thuốc nhuộm, đệm HEPES, không pyruvate có thể tạo ra bốn yếu tố gây nhiễu cùng lúc.

• Tế bào nhạy với pyruvate: đặt DMEM không pyruvate, sau đó chỉ thêm sodium pyruvate ở 0.5 hoặc 1.0 mM vào nhánh so sánh.
• Ứng dụng tạo ảnh không thuốc nhuộm: chọn DMEM không phenol red và xác minh nền trong đúng bộ lọc. Với các reporter xanh lá yếu, điều này có thể quan trọng hơn lựa chọn glucose.
• Ủ CO2 thấp hoặc thao tác mở: sử dụng 10 đến 25 mM HEPES. Xác nhận pH sau 60 phút bên ngoài tủ ấm, với mục tiêu 7.1 đến 7.4.
• Cửa sổ nuôi cấy dài hơn: sử dụng glutamine ổn định khi quy trình vượt quá 72 giờ hoặc khi xuất hiện mất khả năng sống nhạy với ammonia.
• Quy trình cũ: khớp biến thể ATCC hoặc bộ acid amin tiêu chuẩn trước khi điều chỉnh chất bổ sung.

Khi chuyển từ DMEM glucose thấp sang DMEM glucose cao, thực hiện thích nghi qua hai lần cấy chuyền. Đối với MRC-5 (ATCC CCL-171), sự thay đổi đột ngột về thẩm thấu và dinh dưỡng có thể làm thay đổi hình thái trước khi làm thay đổi khả năng sống.

Một phòng thí nghiệm muốn một loại DMEM cho chuyển nạp tạm thời HEK293T (ATCC CRL-3216) và tạo ảnh tế bào sống U-2 OS (ATCC HTB-96). Lựa chọn ban đầu thường là DMEM glucose cao có phenol red, L-glutamine và sodium pyruvate vì nó hỗ trợ tăng trưởng. Điều đó sẽ không lý tưởng cho tạo ảnh.

Chia lựa chọn thành hai môi trường. Để mở rộng và chuyển nạp HEK293T, bắt đầu với DMEM glucose cao, 4.5 g/L glucose, glutamine ổn định, có phenol red và pyruvate ở 1.0 mM. Kiểm tra phát hành lô nên cho thấy pH khoảng 7.2, độ thẩm thấu gần 300 đến 315 mOsmol/kg, endotoxin ≤0.25 EU/mL và không phát hiện mycoplasma bằng qPCR.

Đối với tạo ảnh U-2 OS, chọn DMEM glucose cao không có phenol red, thêm 10 đến 25 mM HEPES nếu đĩa nằm ngoài 5% CO2, và bỏ pyruvate trừ khi sinh học yêu cầu. Trong lần chạy đánh giá, so sánh độ hợp lưu sau 48 giờ, hình thái và nền huỳnh quang. Giữ môi trường duy trì ít nhất 90% khả năng sống và cho nền thấp hơn trong kênh reporter.

Đối với mở rộng quy mô hoặc nuôi cấy mật độ cao, đo môi trường đã sử dụng có giá trị dự đoán cao hơn tên gọi trong catalog. Tài liệu quy trình CHO và hybridoma nhiều lần cho thấy glucose, glutamine, lactate và ammonia phải được cân bằng cùng nhau, không được chọn như các ô chọn riêng biệt [2] Ozturk SS et al. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.

1. Eagle H. Các yêu cầu acid amin đặc hiệu của một chủng tế bào động vật có vú trong nuôi cấy mô. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
2. Ozturk SS, Palsson BO. Động học tăng trưởng, chuyển hóa và sản xuất kháng thể của nuôi cấy tế bào hybridoma: tác động của nồng độ serum, nồng độ oxy hòa tan và pH môi trường trong lò phản ứng mẻ. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
3. Altamirano C, Paredes C, Cairo JJ, Godia F. Cải thiện công thức môi trường nuôi cấy tế bào CHO: thay thế đồng thời glucose và glutamine. Biotechnol Prog 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
4. Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, et al. Điều kiện xác định về mặt hóa học cho tạo lập và nuôi cấy iPSC người. Stem Cell Reports 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001

Tôi nên chọn DMEM glucose 4.5 g/L hay 1.0 g/L cho chuyển nạp HEK293T?

Khi nào nên sử dụng DMEM không phenol red thay vì DMEM thông thường?

HEPES có cần thiết nếu tủ ấm của tôi đã chạy ở 5% CO2 không?

Tại sao tôi nên đặt DMEM không có sodium pyruvate?