Thuốc thử nuôi cấy tế bào
Một lô xuất xưởng DPBS ở pH 7.21 và 296 mOsmol/kg cho bạn biết nhiều hơn so với một mô tả đệm chung chung. Danh mục này bao gồm 98 thuốc thử nuôi cấy tế bào được sử dụng trong các bước đệm/rửa, phân tách, mở rộng và đông lạnh. Người mua thường bắt đầu với PBS hoặc HBSS, sau đó thêm Trypsin-EDTA, Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine, chất bổ sung ITS hoặc B-27 và một môi trường đông lạnh phù hợp. Mỗi lô được kiểm tra theo các thông số kỹ thuật xuất xưởng trước khi vận chuyển.
Thuốc thử nuôi cấy tế bào: có gì trong danh mục này và cách lựa chọn
Phạm vi danh mục: 98 thuốc thử thuộc các nhóm PBS / DPBS, HBSS, đệm HEPES, Trypsin-EDTA, Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine, chất bổ sung ITS, chất bổ sung B-27, môi trường đông lạnh tế bào, và enzyme phân tách bao gồm Collagenase, Dispase, và Accutase.
Quy trình làm việc phổ biến nhất là đệm/rửa → phân tách → mở rộng nuôi cấy → đông lạnh. Đối với các dòng bám dính như HeLa (ATCC CCL-2), Vero (ATCC CCL-81), MDCK (ATCC CCL-34), và NIH 3T3 (ATCC CRL-1658), việc lựa chọn thuốc thử ảnh hưởng đến thời gian tách tế bào, khả năng phục hồi màng, và khả năng sống sau cấy chuyền. Đối với HEK293T (ATCC CRL-3216), độ trôi osmolality trong quá trình rửa và thiết lập transfection thường quan trọng hơn người dùng dự đoán.
Hãy bắt đầu với loại tế bào, điều kiện huyết thanh, và xét nghiệm hạ nguồn.
Đối với nuôi cấy tế bào động vật có vú thường quy, chọn DPBS không có calcium và magnesium để rửa trước Trypsin-EDTA. Đối với các đơn lớp biểu mô hoặc nhạy hơn với lực cắt, hãy dùng độ mạnh của enzyme và thời gian tiếp xúc làm các biến kiểm soát. Đối với mở rộng nuôi cấy với huyết thanh giảm, kết hợp L-Glutamine hoặc lập kế hoạch nguồn glutamine ổn định với bổ sung kiểu ITS hoặc B-27, vì sự phân hủy glutamine và hình thành ammonia có thể làm thay đổi hiệu suất tăng trưởng trong vài ngày [1] Ozturk SS, Palsson BO. Biotechnol Prog 1990;6(2):121-128. doi:10.1021/bp00002a005.
Cây quyết định
1. Bạn có rửa tế bào trước khi phân tách không?
- Dùng DPBS không có calcium và magnesium cho quy trình Trypsin-EDTA.
- Dùng HBSS khi thao tác ngắn bên ngoài môi trường hoàn chỉnh cần muối cân bằng và hỗ trợ glucose.
- Dùng đệm HEPES khi đĩa ở ngoài điều kiện 5% CO₂ hơn 10 phút.
2. Tế bào là dạng bám dính hay huyền phù?
- Bám dính: chọn Trypsin-EDTA, Accutase, Dispase, hoặc Collagenase dựa trên độ bền của chất nền ngoại bào.
- Huyền phù: ưu tiên các chất bổ sung mở rộng nuôi cấy, kháng sinh khi có lý do phù hợp, và môi trường đông lạnh.
- Nuôi cấy sơ cấp hoặc giàu chất nền: thử Collagenase ở 0.5-2.0 mg/mL và ghi nhận sản lượng tế bào sống trên mỗi cm².
3. Xét nghiệm điểm cuối có nhạy với kháng sinh hoặc enzyme tồn dư không?
- Đối với transfection với HEK293T (ATCC CRL-3216), tránh mang theo kháng sinh thường quy trong quá trình tối ưu hóa.
- Đối với xét nghiệm chuyển hóa trên HepG2 (ATCC HB-8065), theo dõi tuổi của glutamine và nền glucose.
- Đối với chụp ảnh trên U-2 OS (ATCC HTB-96), rửa sạch phenol red và enzyme tồn dư nếu nền huỳnh quang là vấn đề quan trọng.
Trả lời ngắn gọn: chọn thuốc thử nhẹ nhất cho sản lượng tế bào cần thiết trong một khoảng thời gian có thể tái lập.
So sánh thông số giữa các sản phẩm
| Nhóm thuốc thử | Kiểm tra xuất xưởng điển hình | Ví dụ giá trị lô hiện tại | Ghi chú lựa chọn thường gặp |
|---|---|---|---|
| PBS / DPBS | pH 7.0-7.4, osmolality 260-320 mOsmol/kg, vô trùng | pH 7.21, 296 mOsmol/kg, USP <71> đạt | Chọn loại không có calcium và magnesium trước khi trypsin hóa. |
| HBSS | pH 7.1-7.5, osmolality 270-330 mOsmol/kg, endotoxin | pH 7.32, 305 mOsmol/kg, endotoxin ≤0.25 EU/mL bằng LAL | Hữu ích cho các bước rửa ngắn khi ưu tiên muối có chứa glucose. |
| HEPES buffer | Nồng độ HEPES 1.0 M hoặc định dạng 25 mM, pH 7.20-7.50 | pH 7.38 ở 20-25°C, không phát hiện bioburden | Cải thiện kiểm soát pH trong khi thao tác trên bàn ngoài tủ ấm CO₂. |
| Trypsin-EDTA | Hoạt tính trypsin, nồng độ EDTA, vô trùng, mycoplasma qPCR | 0.25% trypsin, 0.53 mM EDTA, không phát hiện mycoplasma | Dùng thời gian phơi nhiễm được kiểm soát, thường 2-6 phút cho nhiều đơn lớp bất tử hóa. |
| Penicillin-Streptomycin | Hoạt lực, độ trong, vô trùng | 10,000 U/mL penicillin, 10,000 µg/mL streptomycin, USP <71> đạt | Tốt như một thuốc thử kiểm soát rủi ro, không thay thế cho kỹ thuật vô trùng. |
| L-Glutamine | Nồng độ, pH, osmolality, ngoại quan | 200 mM, pH 6.1, dung dịch trong | Lập kế hoạch kích thước aliquot vì glutamine phân hủy khi bảo quản ấm [1] Ozturk SS, Palsson BO. Biotechnol Prog 1990;6(2):121-128. doi:10.1021/bp00002a005. |
| Cell freezing media | Nồng độ DMSO, vô trùng, thử nghiệm phục hồi | Định dạng 10% DMSO, HEK293T (ATCC CRL-3216) khả năng sống sau rã đông 91.8% tại 24 h | Phù hợp tốc độ làm lạnh, mật độ lọ, và ưu tiên có huyết thanh hoặc không huyết thanh. |
Đối với các thuốc thử dùng nhiều, hãy yêu cầu Certificate of Analysis hiện tại với các trường pH, osmolality, endotoxin, vô trùng, và mycoplasma trước khi phát hành đơn mua hàng.
Các lỗi thường gặp
Dùng sai định dạng muối trước khi phân tách. Calcium và magnesium có thể làm chậm sự giải phóng bởi Trypsin-EDTA đối với một số đơn lớp. Nếu thời gian tách HeLa (ATCC CCL-2) chuyển từ 3 phút lên 8 phút sau khi thay đổi đệm, hãy kiểm tra xem đệm rửa có chứa cation hóa trị hai hay không.
Để enzyme trên tế bào quá lâu. Phơi nhiễm quá mức có thể làm giảm phục hồi protein màng và giảm hiệu quả bám dính sau cấy chuyền. Đối với Vero (ATCC CCL-81), khoảng quy trình thực tế thường là 3-5 phút ở 37°C với xác nhận bằng quan sát, sau đó trung hòa kịp thời.
Xem kháng sinh như một giải pháp cố định vĩnh viễn. Penicillin-Streptomycin có thể ức chế tăng trưởng vi khuẩn nhìn thấy được trong khi các vấn đề kỹ thuật vẫn chưa được giải quyết. Đối với ngân hàng tế bào và mở rộng nuôi cấy quan trọng cho xét nghiệm, dùng các lần cấy chuyền không kháng sinh trước chỉ số đọc cuối cùng và duy trì mycoplasma qPCR trong kế hoạch xuất xưởng.
Bỏ qua biến thiên của huyết thanh và chất bổ sung. Lựa chọn huyết thanh và chất bổ sung ảnh hưởng đến tăng sinh, trạng thái biệt hóa, và đáp ứng stress. Các thảo luận về thay thế huyết thanh thường tập trung vào đạo đức và nguồn cung, nhưng điểm phân tích đơn giản hơn: xác định điểm cuối đo được trước khi thay đổi chất bổ sung [2] van der Valk J et al. ALTEX 2018;35(1):99-118. doi:10.14573/altex.1705101.
Thẻ sản phẩm
PBS / DPBS: đệm rửa thường quy ở định dạng không có calcium và magnesium hoặc định dạng muối đầy đủ. Khoảng xuất xưởng điển hình: pH 7.0-7.4 và 260-320 mOsmol/kg.
HBSS: dung dịch muối cân bằng cho các bước thao tác ngắn, vận chuyển giữa các phòng, và điều kiện rửa khi muối có chứa glucose hữu ích.
HEPES buffer: ổn định pH cho quy trình trên bàn, thiết lập kính hiển vi, và thao tác đĩa ngoài CO₂ được kiểm soát.
Trypsin-EDTA: phân tách tế bào bám dính ở định dạng trypsin 0.05% hoặc 0.25%. Chọn theo độ bền bám dính của tế bào và mức tác động chấp nhận được lên marker bề mặt.
Penicillin-Streptomycin: dung dịch gốc kháng sinh 100× thông dụng, thường là 10,000 U/mL penicillin và 10,000 µg/mL streptomycin.
L-Glutamine: dung dịch gốc 200 mM để bổ sung vào môi trường. Dùng aliquot nhỏ và tránh làm ấm lặp lại.
ITS supplement: hỗ trợ insulin, transferrin, và selenium cho các nghiên cứu tăng trưởng giảm huyết thanh.
B-27 supplement: hỗ trợ nuôi cấy thần kinh và chuyên biệt khi cần bổ sung xác định.
Cell freezing media: định dạng bảo quản lạnh có huyết thanh và không huyết thanh, thường với 10% DMSO và làm lạnh tốc độ kiểm soát.
Collagenase / Dispase / Accutase: lựa chọn enzyme cho mô sơ cấp, tấm biểu mô, thao tác organoid, và nhu cầu cấy chuyền nhẹ nhàng hơn.
Tóm tắt đơn hàng: chọn nhóm thuốc thử, quy cách đóng gói, yêu cầu lọc vô trùng, và các trường CoA cần cho QC khi nhận hàng. Đối với các phòng thí nghiệm đặt hàng định kỳ, chúng tôi có thể báo giá thùng hỗn hợp gồm PBS, Trypsin-EDTA, L-Glutamine, và môi trường đông lạnh.
MIỄN PHÍ VẬN CHUYỂN TOÀN CẦUHướng dẫn liên quan
- Cách chọn PBS so với DPBS: thành phần muối, calcium và magnesium, và tác động đến phân tách.
- Hướng dẫn thời gian Trypsin-EDTA: khoảng tách tế bào thực tế cho HEK293T (ATCC CRL-3216), CHO-K1 (ATCC CCL-61), Vero (ATCC CCL-81), và MDCK (ATCC CCL-34).
- Xử lý glutamine trong phòng ấm: vì sao dung dịch gốc 200 mM nên được chia aliquot và bảo vệ khỏi chu kỳ nhiệt độ lặp lại.
- So sánh môi trường đông lạnh: tỷ lệ phần trăm DMSO, khả năng sống sau rã đông, phục hồi tại 24 h, và hình thái ở passage-one.
Đối với các nhóm phát triển thượng nguồn, kiểm soát thuốc thử trở thành một phần của kiểm soát quy trình. Hiệu suất nuôi cấy tế bào động vật có vú nhạy với độ ổn định dinh dưỡng, kiểm soát nhiễm, và khả năng tái lập khi thao tác, đặc biệt khi chuyển từ bình nuôi sang hệ thống bioreactor được kiểm soát [3] Butler M, Meneses-Acosta A. Appl Microbiol Biotechnol 2012;96(4):885-894. doi:10.1007/s00253-012-4451-z.
