α-MEM (MEM alfa) e terreno minimo essenziale

Harry Eagle pubblicò il terreno minimo essenziale nel 1959 su Science, dopo alcuni anni passati a stabilire in modo sistematico di che cosa una cellula di mammifero abbia davvero bisogno in coltura. MEM è deliberatamente minimo: tredici amminoacidi essenziali, otto vitamine, glucosio e i sei sali inorganici della soluzione salina bilanciata di Earle (cloruro di calcio, cloruro di potassio, solfato di magnesio, cloruro di sodio, fosfato di sodio e bicarbonato di sodio). Nient'altro. Quel minimalismo era il punto: faceva di MEM una linea di base definita rispetto alla quale verificare i fabbisogni di qualunque tipo cellulare.

α-MEM è la «modifica alfa», pubblicata nel 1971 da Clifford Stanners, Gerald Eliceiri e Howard Green mentre studiavano i ribosomi in cellule ibride topo-criceto. Serviva loro un terreno più ricco, capace di sostenere cellule ibride ed esigenti senza passare alle concentrazioni amminoacidiche molto elevate del DMEM. La loro modifica lasciò intatte la base salina e il glucosio di MEM e vi aggiunse nutrienti:

• Tutti gli amminoacidi non essenziali — alanina, asparagina, acido aspartico, acido glutammico, glicina, prolina e serina, più la cisteina
• Piruvato di sodio a 110 mg/L (1 mM)
• Acido ascorbico (vitamina C) a 50 mg/L, biotina a 0.1 mg/L, vitamina B12 a circa 1.3 mg/L
• Acido lipoico a 0.2 mg/L
• Facoltativamente, ribonucleosidi e desossiribonucleosidi

Ne risulta un terreno nutrizionalmente molto più ricco di MEM ma con la stessa composizione ionica e lo stesso fabbisogno di CO2: ed è questo il motivo per cui α-MEM si comporta diversamente dal DMEM, benché entrambi siano «MEM arricchiti».

Questa è la formulazione standard di MEM con i sali bilanciati di Earle, cioè il terreno venduto come «MEM», «EMEM» o «MEM Eagle» senza ulteriori precisazioni.

Sali inorganici e altri componenti

Amminoacidi (mg/L) — soltanto i tredici essenziali

L-arginina·HCl 126; L-cistina·2HCl 31; L-istidina·HCl·H2O 42; L-isoleucina 52; L-leucina 52; L-lisina·HCl 73; L-metionina 15; L-fenilalanina 32; L-treonina 48; L-triptofano 10; L-tirosina (come sale disodico diidrato) 52; L-valina 46; più la L-glutammina 292.

Vitamine (mg/L) — otto

Cloruro di colina 1; D-pantotenato di calcio 1; acido folico 1; niacinamide 1; piridossale·HCl 1; tiamina·HCl 1; i-inositolo 2; riboflavina 0.1.

Questo è tutto il terreno. MEM non contiene amminoacidi non essenziali, nucleosidi, piruvato, ascorbato, biotina, vitamina B12, acido lipoico né oligoelementi. Il minimalismo è voluto: l'obiettivo di Eagle era stabilire il fabbisogno minimo di una cellula di mammifero, e tutto il resto doveva arrivare dal siero. È anche il motivo per cui MEM resta utile oggi in virologia, nella produzione di vaccini e negli studi sui fabbisogni nutrizionali, dove componenti aggiunti falserebbero il risultato.

Esiste anche una versione di MEM con i sali bilanciati di Hanks, identica salvo che il bicarbonato di sodio scende a circa 350 mg/L per l'impiego a CO2 atmosferica (si veda più avanti la parte sui sali). Altre due varianti diffuse sono il MEM con amminoacidi non essenziali già aggiunti e il MEM 2x per gli strati di copertura nei saggi di placca.

Formulazione standard di α-MEM (con nucleosidi; la versione senza nucleosidi è identica, meno gli otto nucleosidi):

Sali inorganici e altri componenti

Amminoacidi (mg/L)

L-alanina 25; L-arginina·HCl 126; L-asparagina·H2O 50; acido L-aspartico 30; L-cisteina·HCl·H2O 100; L-cistina·2HCl 31; acido L-glutammico 75; glicina 50; L-istidina·HCl·H2O 42; L-isoleucina 52; L-leucina 52; L-lisina·HCl 73; L-metionina 15; L-fenilalanina 32; L-prolina 40; L-serina 25; L-treonina 48; L-triptofano 10; L-tirosina (come sale disodico diidrato) 52; L-valina 46.

Vitamine (mg/L)

Acido ascorbico 50; i-inositolo 2; cloruro di colina 1; D-pantotenato di calcio 1; acido folico 1; niacinamide 1; piridossale·HCl 1; tiamina·HCl 1; riboflavina 0.1; biotina 0.1; vitamina B12 ~1.3.

Nucleosidi (mg/L, nella versione con nucleosidi)

Adenosina 10; citidina 10; guanosina 10; uridina 10; timidina 10; 2'-desossiadenosina 10; 2'-desossiguanosina 10; 2'-desossicitidina·HCl 11.

Due contrasti con il DMEM vanno tenuti a mente. α-MEM ha un quarto del glucosio (1,000 contro 4,500 mg/L) e molto meno bicarbonato (2,200 contro 3,700 mg/L, quindi 5% di CO2 anziché 10%). In compenso ha un ventaglio nutritivo più ampio — ascorbato, biotina, B12, acido lipoico e il pannello completo degli amminoacidi non essenziali — nulla di cui è presente nel DMEM. α-MEM non è un DMEM più debole: è un progetto diverso.

È la scelta più gravida di conseguenze al momento di ordinare α-MEM, e sbagliarla manda in fumo silenziosamente gli esperimenti di selezione.

Le cellule sintetizzano i nucleotidi per due vie: la via de novo, che costruisce purine e pirimidine da zero e dipende dalla diidrofolato reduttasi (DHFR) e dalla timidilato sintasi, e la via di recupero, che riutilizza nucleosidi preformati grazie a enzimi come HGPRT e timidina chinasi. I nucleosidi presenti nel terreno alimentano la via di recupero.

Usare α-MEM senza nucleosidi quando la via di recupero deve essere bloccata o quando la sintesi de novo è il marcatore di selezione:

• Selezione basata su DHFR in CHO-DXB11 e CHO-DG44. Queste linee sono carenti di DHFR e non sanno produrre nucleotidi de novo. Sopravvivono solo se i nucleosidi vengono forniti: perciò α-MEM senza nucleosidi è esattamente la pressione selettiva che individua le cellule che hanno acquisito un vettore di espressione portatore di DHFR. Fornire nucleosidi annulla del tutto la selezione. È il caso d'uso classico, ed è la ragione per cui α-MEM senza nucleosidi è un reagente standard di bioproduzione.
• Amplificazione con metotrexato. Stessa logica: il metotrexato inibisce la DHFR, e i nucleosidi nel terreno salverebbero proprio le cellule contro cui si sta selezionando.
• Selezione HAT e HT nel lavoro sugli ibridomi, dove l'intento è controllare quale via resti disponibile.

Usare α-MEM con nucleosidi quando serve semplicemente un terreno ricco: espansione di routine delle cellule stromali mesenchimali, coltura di midollo osseo, crescita di cellule primarie e mantenimento delle linee carenti di DHFR prima che la selezione cominci. I nucleosidi riducono il carico metabolico della sintesi dei nucleotidi e in genere migliorano la crescita delle cellule primarie più esigenti.

Se il protocollo non nomina affatto i nucleosidi e non si sta facendo selezione, la versione con nucleosidi è l'impostazione predefinita più sicura. Se il protocollo parla di DHFR, metotrexato, HAT o HT, va letto con attenzione: la risposta è di norma «senza», e i due prodotti vengono confusi di frequente perché i nomi di catalogo differiscono per una sola parola.

MEM viene fornito su due basi saline diverse, e la differenza dipende interamente da dove si intende tenere la coltura.

MEM con i sali bilanciati di Earle contiene 2,200 mg/L di bicarbonato di sodio ed è pensato per un incubatore al 5% di CO2. È la forma standard di laboratorio ed è ciò che si intende per «MEM» senza ulteriori precisazioni. α-MEM usa questa base.

MEM con i sali bilanciati di Hanks contiene solo circa 350 mg/L di bicarbonato di sodio ed è pensato per recipienti sigillati o per la CO2 atmosferica: storicamente per il trasporto dei tessuti, per la coltura in fiasca chiusa e per le procedure eseguite al bancone. Se si mette un MEM su base di Hanks in un incubatore al 5% di CO2 dentro una fiasca ventilata, il pH scende oltre la capacità del tampone.

La regola vale ben oltre MEM: concentrazione di bicarbonato e CO2 dell'incubatore sono una coppia obbligata, perché in questi terreni il pH è fissato dal rapporto fra bicarbonato e CO2 disciolta. Ogni volta che su una scheda tecnica compare un valore di bicarbonato inaspettatamente basso, conviene verificare se il prodotto sia una formulazione su base di Hanks o per recipiente sigillato prima di metterlo in incubatore.

Cellule stromali mesenchimali (MSC). α-MEM è la base standard per l'espansione delle MSC umane e animali derivate da midollo osseo e da tessuto adiposo, di norma con il 10–20% di FBS o con un integratore definito. Il suo poco glucosio è qui un pregio: un glucosio elevato ha effetti documentati sulla proliferazione delle MSC e sul loro potenziale differenziativo.

Colture ossee ed ematopoietiche. Osteoblasti, saggi di differenziamento osteoclastico, colture stromali di midollo osseo e colture midollari di lunga durata usano per convenzione α-MEM. Il suo contenuto di ascorbato è direttamente rilevante nel lavoro sugli osteoblasti, perché l'ascorbato serve all'idrossilazione del collagene e alla deposizione della matrice.

CHO-DXB11 e CHO-DG44. Come descritto sopra, α-MEM con e senza nucleosidi è l'accoppiata standard per la selezione DHFR e per l'amplificazione con metotrexato in queste linee di produzione.

Cellule primarie in generale. Condrociti, cellule della polpa dentaria, strati nutritivi di cheratinociti, fibroblasti primari e molte altre colture primarie rendono meglio in α-MEM che nel MEM semplice, grazie agli amminoacidi non essenziali, al piruvato, all'ascorbato e ai nucleosidi.

Il MEM semplice resta in uso dove serve una base minima e ben definita: virologia e produzione di vaccini su Vero e MRC-5, saggi di placca e studi sui fabbisogni nutrizionali, dove componenti aggiunti falserebbero il risultato.

Attenzione al calcio: α-MEM ne contiene 1.8 mM, come il DMEM. Questo va bene per le colture adese e per quelle in differenziamento, ma ne fa una base scadente per i protocolli su cheratinociti che richiedono poco calcio.

CO2. I 2,200 mg/L (26 mM) di bicarbonato di α-MEM sono calibrati sul 5% di CO2. È l'impostazione standard degli incubatori, quindi α-MEM mantiene il pH in modo più prevedibile del DMEM già così com'è.

Glutammina. 2 mM (292 mg/L) nelle formulazioni con glutammina. Si degrada in soluzione ad ammoniaca, perciò il terreno senza glutammina con aggiunta fresca, oppure il dipeptide stabile L-alanil-L-glutammina, dà colture a lungo termine più costanti: aspetto particolarmente rilevante nell'espansione delle MSC, che dura settimane.

Siero. Il 10% di FBS è la scelta abituale; i protocolli per MSC prevedono spesso il 15–20% e, sempre più spesso, un integratore definito o a base di lisato piastrinico umano per le lavorazioni di grado clinico.

Stabilità dell'ascorbato. I 50 mg/L di acido ascorbico di α-MEM sono davvero utili ma davvero instabili: in soluzione si ossidano nel giro di giorni o settimane. Per il differenziamento osteogenico, dove l'ascorbato guida la deposizione di collagene, conviene integrare con ascorbato-2-fosfato fresco anziché contare su quello rimasto in una bottiglia aperta da un mese. L'ascorbato-2-fosfato è la forma stabilizzata usata nei protocolli di differenziamento proprio per questa ragione.

Conservazione. 2–8 °C al buio, di norma 12–24 mesi a confezione integra. Dopo l'aggiunta della glutammina, circa quattro settimane. α-MEM è più fotosensibile del MEM semplice, perché ascorbato, riboflavina e folato si fotodegradano tutti. Va tenuto in un frigorifero chiuso.

α-MEM in polvere viene fornito senza bicarbonato di sodio: se ne aggiungono 2.2 g/L alla ricostituzione, si corregge il pH circa 0.2 unità sotto il valore obiettivo per compensare l'aumento durante la filtrazione e si sterilizza per filtrazione a 0.22 µm.

Ordinare la versione sbagliata quanto a nucleosidi. I due prodotti differiscono per una sola parola nel nome di catalogo e in tutto e per tutto nel comportamento sotto selezione con DHFR o con metotrexato. Va controllata la scheda tecnica, non l'etichetta sullo scaffale.

Considerare α-MEM un DMEM a basso glucosio. Non lo è. Bicarbonato diverso (2,200 contro 3,700 mg/L), fabbisogno di CO2 diverso, corredo vitaminico diverso, e contiene nucleosidi, ascorbato, acido lipoico e piruvato che al DMEM mancano.

Contare sull'ascorbato della bottiglia per gli esperimenti di differenziamento. L'acido ascorbico in soluzione si degrada. Per il lavoro osteogenico va usato ascorbato-2-fosfato come integrazione fresca.

Mettere un MEM su sali di Hanks in un incubatore a CO2. I suoi 350 mg/L di bicarbonato non riescono a tamponare al 5% di CO2 e la coltura si acidifica.

Spostare le colture di MSC fra α-MEM e DMEM a studio in corso. Cambiano glucosio, calcio e corredo di micronutrienti; con essi cambiano la velocità di proliferazione e il potenziale differenziativo.