세포주에 맞는 DMEM 선택 방법
DMEM 선택이 잘못되면 HEK293T 형질주입 실험은 24시간에는 정상처럼 보이더라도 72시간에는 수율을 놓칠 수 있습니다. 일반적인 구분은 고포도당 4.5 g/L와 저포도당 1.0 g/L이지만, 페놀 레드, 피루브산, HEPES, 글루타민 화학도 그만큼 중요한 경우가 많습니다. 이 가이드는 실용적인 선택 규칙으로 시작한 뒤 pH 7.21, 삼투질농도 312 mOsmol/kg, 96시간에서 HEK293T 생존율 96.3%와 같은 측정된 품질관리 확인을 보여줍니다.
문제점(구체적인 예시 포함)
흔한 사례: HEK293T (ATCC CRL-3216)는 일상 계대 중 고포도당 DMEM에서 잘 자라다가, 피루브산나트륨이 조용히 제거되고 안정형 글루타민에서 유리 L-글루타민으로 바뀐 시약 변경 후 생존율이 92%에서 78%로 떨어집니다.
이것은 원인 불명의 세포주 실패가 아닙니다. 제형 불일치입니다.
DMEM 선택은 보통 여섯 가지 차원, 즉 포도당 수준, 페놀 레드, L-글루타민 형태, 피루브산나트륨, HEPES, 아미노산 조합에 따라 결정됩니다. 고포도당 4.5 g/L는 빠른 해당작용 세포주와 고밀도 배양을 지원합니다. 저포도당 1.0 g/L는 세포가 젖산 축적, 형태 변화 또는 대사 민감 판독값을 보일 때 더 나은 시작점인 경우가 많습니다.
- 포도당: HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96), 그리고 많은 고밀도 작업흐름에는 4.5 g/L. 더 느린 일차세포 유사 세포 또는 대사 민감 연구에는 1.0 g/L.
- 페놀 레드: 일상 배양과 시각적 pH 드리프트 확인에는 유지합니다. 형광 이미징, 호르몬 민감 분석 또는 약한 리포터 판독값에는 제거합니다.
- L-글루타민: 유리 L-글루타민이 전통적이지만, 안정형 글루타민 디펩타이드는 더 긴 공급 기간 동안 암모니아 증가를 줄입니다.
- 피루브산나트륨: 1.0 mM에서 산화 스트레스 완충과 회복에 유용합니다. 피루브산이 대사 플럭스 분석에 영향을 줄 때는 제외합니다.
- HEPES: 5% CO2 배양기 밖의 저CO2 취급, 현미경 관찰, 운송 기간에는 10~25 mM에서 유용합니다.
- 아미노산 조합: 표준 DMEM은 일상 유지에 적합하고, ATCC 변형은 기존 세포은행 프로토콜과 맞추는 데 도움이 되며, 고급 아미노산 조합은 더 높은 밀도 또는 스트레스에 취약한 배양을 지원합니다.
Mechanism (figure 1, figure 2)
그림 1, 포도당과 젖산 압력. 고포도당 DMEM은 4.5 g/L 포도당에서 시작하며, 이는 빠르게 성장하는 세포에 더 많은 탄소 예비량을 제공합니다. 절충점은 젖산 생성입니다. 고밀도 HEK293T (ATCC CRL-3216) 또는 HeLa (ATCC CCL-2) 배양에서 20~25 mM을 넘는 젖산은 성장 둔화, 7.0 미만으로의 pH 드리프트, 더 이른 배지 고갈과 자주 동시에 나타납니다.
그림 2, 완충제와 질소 화학. 중탄산염 완충 DMEM은 CO2 제어를 중심으로 설계되었습니다. HEPES는 벤치 취급 또는 살아있는 세포 이미징 중 완충 능력을 더해 주며, 이때 배양 접시가 실내 공기 중에 30~90분 동안 놓일 수 있습니다. 글루타민 화학이 중요한 이유는 유리 L-글루타민이 보관 및 배양 중 분해되는 반면, 안정형 글루타민은 72~120시간 실험에서 암모니아 부하를 줄일 수 있기 때문입니다.
피루브산은 다른 결정 지점에 있습니다. 산화 스트레스로부터의 회복을 지원하고 세포에 추가 탄소원을 제공할 수 있지만, 미토콘드리아 표현형을 가릴 수도 있습니다. Seahorse 방식 대사 분석, 젖산 추적 또는 피루브산 반응 연구의 경우 피루브산 무첨가 DMEM으로 시작하고 피루브산을 통제 변수로 추가하십시오.
기본 논리는 오래되었지만 여전히 유용합니다. Eagle의 정의된 영양소 연구는 아미노산, 비타민, 염류, 포도당을 배경 성분이 아니라 활성 실험 변수로 다루어야 하는 이유를 확립했습니다 [1] 이글 H. 사이언스 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.
측정 방법
이름만 보고 DMEM을 선택하지 마십시오. 측정된 로트 값을 확인한 다음 세포주와 분석에 맞추십시오.
| 측정 항목 | 일반적인 출하 값 | 허용 범위 | 중요한 이유 |
|---|---|---|---|
| 20~25°C에서의 pH | 7.21 | 7.0~7.4 | 배양이 시작되기 전에 CO2와 완충제 불일치를 표시합니다 |
| 삼투질농도 | 312 mOsmol/kg | 260~320 mOsmol/kg | 높은 값은 MDCK (ATCC CCL-34) 및 MRC-5 (ATCC CCL-171)에 스트레스를 줍니다 |
| 엔도톡신, LAL | ≤0.25 EU/mL | ≤0.50 EU/mL | 염증 및 상피 판독값에 중요합니다 |
| 마이코플라스마, qPCR | 검출되지 않음 | 검출되지 않음 | 성장 속도 및 전사체 데이터를 보호합니다 |
| 무균성 | USP <71> 통과 | 성장 없음 | 일상 배양으로 출하하는 데 필요합니다 |
| 성장 촉진 | 96 h에서 HEK293T 생존율 96.3% | 생존율 ≥90.0% | 제형이 민감한 빠른 성장 세포주를 지원하는지 확인합니다 |
포도당 선택의 경우 48시간과 72시간 후 사용 후 배지를 측정하십시오. 포도당이 1.5 g/L 이상 남아 있지만 젖산이 22 mM을 초과한다면, 영양소 밀도를 더 높이는 것이 답인 경우는 드뭅니다. 생존율이 90% 이상으로 유지되는 동안 포도당이 0.5 g/L 미만으로 떨어진다면, 고포도당 또는 공급 전략이 더 타당합니다.
세포 유형별 허용 한계값(표)
| 세포주 | 일반적인 DMEM 시작점 | 포도당 선호도 | 피루브산 | 페놀 레드 | HEPES 참고사항 |
|---|---|---|---|---|---|
| HEK293T (ATCC CRL-3216) | L-글루타민 포함 고포도당 DMEM | 4.5 g/L | 선택 사항, 회복을 위해 종종 1.0 mM | 일상 계대에는 포함, 이미징에는 미포함 | 형질주입 취급을 위해 플레이트가 CO2 밖으로 나가면 10~25 mM |
| HeLa (ATCC CCL-2) | 고포도당 DMEM, 표준 아미노산 | 4.5 g/L | 보통 허용됨 | 형광 또는 에스트로겐 민감 작업에는 제거 | 30 min보다 긴 현미경 관찰 세션 중 유용함 |
| MRC-5 (ATCC CCL-171) | 저포도당 DMEM 또는 일치하는 기존 변형 | 1.0 g/L | 노화 표지가 모니터링될 경우 신중하게 사용 | 일상 섬유아세포 배양에는 포함 | 저CO2 취급이 필요하지 않으면 과도한 완충제는 피함 |
| Vero (ATCC CCL-81) | 확장용 고포도당 DMEM | 4.5 g/L | 해동 회복 중 종종 도움이 됨 | 이미징 종말점에 무염료가 필요하지 않으면 포함 | 배양기 밖 운송 및 감염 설정에 좋음 |
| MDCK (ATCC CCL-34) | 저~중간 포도당 DMEM, 엄격한 삼투압 제어 | 처음에는 1.0 g/L, 이후 최적화 | 분석 의존적 | 장벽 이미징에는 제거 | 개방 플레이트 작업이 45 min을 초과할 때 사용 |
| HepG2 (ATCC HB-8065) | 피루브산 포함 고포도당 DMEM | 4.5 g/L | 일반적으로 1.0 mM | 대사 형광 분석에는 미포함 | 간 관련 분석은 긴 취급을 포함하는 경우가 많아 유용함 |
| U-2 OS (ATCC HTB-96) | 고포도당 DMEM, 이미징 등급 선택지 | 4.5 g/L | 선택 사항 | 살아있는 세포 형광에는 미포함 | 5% CO2 밖 시간 경과 이미징에 권장 |
| NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) | 일상 확장용 고포도당 DMEM | 4.5 g/L | 보통 허용됨 | 유지 배양에는 포함 | 취급 조건상 필요할 때만 사용 |
이것들은 시작점이지 영구 규칙이 아닙니다. 새 제형에서 최소 두 번 계대한 후 형태, 배가 시간, 사용 후 포도당, 젖산, 생존율을 다시 확인하십시오.
완화 방법
배양은 성장하지만 분석이 불안정하다면, 한 번에 하나의 DMEM 변수만 변경하십시오. 고포도당, 페놀 레드 포함, 유리 L-글루타민, 피루브산 포함에서 무염료, HEPES 완충, 피루브산 무첨가 배지로 완전히 전환하면 한꺼번에 네 가지 교란 변수가 생길 수 있습니다.
- 피루브산에 민감한 세포: 피루브산 무첨가 DMEM을 주문한 다음, 비교군에만 피루브산나트륨을 0.5 또는 1.0 mM으로 추가하십시오.
- 무염료 이미징 응용 분야: 페놀 레드 무첨가 DMEM을 선택하고 정확한 필터 세트에서 배경을 확인하십시오. 약한 녹색 리포터의 경우 이것이 포도당 선택보다 더 중요할 수 있습니다.
- 저CO2 배양 또는 개방 취급: 10~25 mM HEPES를 사용하십시오. 배양기 밖에서 60분 후 pH를 확인하고, 목표를 7.1~7.4로 설정하십시오.
- 더 긴 배양 기간: 실험이 72시간을 초과하거나 암모니아 민감 생존율 손실이 나타날 때 안정형 글루타민을 사용하십시오.
- 기존 프로토콜: 보충제를 조정하기 전에 ATCC 변형 또는 표준 아미노산 조합에 맞추십시오.
저포도당 DMEM에서 고포도당 DMEM으로 전환할 때는 두 계대 적응을 수행하십시오. MRC-5 (ATCC CCL-171)의 경우 갑작스러운 삼투압 및 영양소 변화가 생존율을 바꾸기 전에 형태를 바꿀 수 있습니다.
실무 예시
한 실험실이 HEK293T (ATCC CRL-3216) 일시적 형질주입과 U-2 OS (ATCC HTB-96) 살아있는 세포 이미징에 사용할 하나의 DMEM을 원합니다. 첫 직감은 성장을 지원하기 때문에 페놀 레드, L-글루타민, 피루브산나트륨이 포함된 고포도당 DMEM입니다. 하지만 이것은 이미징에는 이상적이지 않습니다.
선택을 두 배지로 나누십시오. HEK293T 확장 및 형질주입에는 고포도당 DMEM, 4.5 g/L 포도당, 안정형 글루타민, 페놀 레드 포함, 피루브산 1.0 mM으로 시작하십시오. 출하 확인은 약 7.2의 pH, 300~315 mOsmol/kg 부근의 삼투질농도, 엔도톡신 ≤0.25 EU/mL, qPCR에서 마이코플라스마 미검출을 보여야 합니다.
U-2 OS 이미징에는 페놀 레드가 없는 고포도당 DMEM을 선택하고, 플레이트가 5% CO2 밖에 놓이면 10~25 mM HEPES를 추가하며, 생물학적으로 필요하지 않으면 피루브산을 제외하십시오. 적격성 평가 실험에서 48시간 합류도, 형태, 형광 배경을 비교하십시오. 최소 90% 생존율을 유지하고 리포터 채널에서 더 낮은 배경을 제공하는 배지를 유지하십시오.
스케일업 또는 고밀도 배양의 경우, 사용 후 배지 측정이 카탈로그 명명보다 더 예측력이 높습니다. CHO 및 하이브리도마 공정 문헌은 포도당, 글루타민, 젖산, 암모니아가 별도의 체크박스로 선택되는 것이 아니라 함께 균형을 이루어야 함을 반복적으로 보여줍니다 [2] 오즈터크 SS 등. 생명공학 진전 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.
참고문헌(번호 및 DOI 포함)
- 이글 H. 조직 배양에서 포유류 세포 균주의 특정 아미노산 요구사항. 사이언스 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
- 오즈터크 SS, 팔손 BO. 하이브리도마 세포 배양의 성장, 대사 및 항체 생산 동역학: 배치 반응기에서 혈청 농도, 용존 산소 농도, 배지 pH의 영향. 생명공학 진전 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
- 알타미라노 C, 파레데스 C, 카이로 JJ, 고디아 F. CHO 세포 배양 배지 제형의 개선: 포도당과 글루타민의 동시 대체. 생명공학 진전 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
- 첸 G, 굴브랜슨 DR, 허우 Z, 볼린 JM, 루오티 V, 프로바스코 MD 등. 인간 iPSC 유도 및 배양을 위한 화학적으로 정의된 조건. 줄기세포 보고서 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001