Comment choisir DMEM pour votre lignée cellulaire

Un cas fréquent : HEK293T (ATCC CRL-3216) croît bien dans du high-glucose DMEM pendant les passages de routine, puis passe de 92% à 78% de viabilité après un changement de réactif qui a discrètement supprimé sodium pyruvate et remplacé la glutamine stable par de la L-glutamine libre.

Ce n’est pas une défaillance mystérieuse de la lignée cellulaire. C’est une inadéquation de formulation.

Le choix du DMEM se décide généralement selon six dimensions : niveau de glucose, phenol red, forme de L-glutamine, sodium pyruvate, HEPES et jeu d’acides aminés. High glucose, 4.5 g/L, soutient les lignées à glycolyse rapide et les cultures denses. Low glucose, 1.0 g/L, est souvent un meilleur point de départ lorsque les cellules montrent une accumulation de lactate, une morphologie altérée ou des lectures sensibles au métabolisme.

• Glucose : 4.5 g/L pour HEK293T (ATCC CRL-3216), U-2 OS (ATCC HTB-96) et de nombreux flux de travail à haute densité. 1.0 g/L pour des études plus lentes de type primaire ou sensibles au métabolisme.
• Phenol red : conservez-le pour la culture de routine et la dérive visuelle du pH. Supprimez-le pour l’imagerie de fluorescence, les essais sensibles aux hormones ou les lectures de rapporteurs faibles.
• L-glutamine : la L-glutamine libre est conventionnelle, mais le dipeptide de glutamine stable réduit l’augmentation de l’ammoniac pendant les alimentations plus longues.
• Sodium pyruvate : utile à 1.0 mM pour l’amortissement du stress oxydatif et la récupération. Omettez-le lorsque pyruvate affecte les essais de flux métabolique.
• HEPES : utile à 10 à 25 mM pour la manipulation en low-CO2, la microscopie et les périodes de transport hors d’un incubateur à 5% CO2.
• Jeu d’acides aminés : le DMEM standard convient à l’entretien de routine, la modification ATCC aide à correspondre aux protocoles historiques de banques cellulaires, et les jeux d’acides aminés avancés soutiennent les cultures à plus haute densité ou sujettes au stress.

Figure 1, pression du glucose et du lactate. Le high-glucose DMEM commence à 4.5 g/L glucose, ce qui donne aux cellules à croissance rapide une réserve de carbone plus importante. Le compromis est la formation de lactate. Dans les cultures denses de HEK293T (ATCC CRL-3216) ou HeLa (ATCC CCL-2), un lactate supérieur à 20 à 25 mM coïncide souvent avec une croissance plus lente, une dérive du pH sous 7.0 et un épuisement plus précoce du milieu.

Figure 2, chimie du tampon et de l’azote. Le DMEM tamponné au bicarbonate est conçu autour du contrôle du CO2. HEPES ajoute une capacité tampon pendant la manipulation sur paillasse ou l’imagerie de cellules vivantes, lorsque la boîte peut rester à l’air ambiant pendant 30 à 90 minutes. La chimie de la glutamine compte, car la L-glutamine libre se décompose pendant le stockage et la culture, tandis que la glutamine stable peut réduire la charge en ammoniac dans les essais de 72 à 120 heures.

Pyruvate se situe à un autre point de décision. Il peut soutenir la récupération après un stress oxydatif et fournit aux cellules une source de carbone supplémentaire, mais il peut aussi masquer les phénotypes mitochondriaux. Pour les essais métaboliques de type Seahorse, le traçage du lactate ou les études de réponse au pyruvate, commencez avec un DMEM sans pyruvate et ajoutez pyruvate comme variable contrôlée.

La logique basale est ancienne, mais reste utile. Les travaux d’Eagle sur les nutriments définis ont établi pourquoi les acides aminés, vitamines, sels et glucose doivent être traités comme des variables expérimentales actives plutôt que comme des ingrédients de fond [1] Eagle H. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501.

Ne choisissez pas un DMEM uniquement à partir de son nom. Confirmez les valeurs mesurées du lot, puis associez-les à la lignée cellulaire et à l’essai.

Pour le choix du glucose, mesurez les milieux usés après 48 et 72 heures. Si le glucose reste au-dessus de 1.5 g/L mais que le lactate dépasse 22 mM, passer à une densité nutritionnelle encore plus élevée est rarement la réponse. Si le glucose tombe sous 0.5 g/L alors que la viabilité reste au-dessus de 90%, une stratégie high-glucose ou d’alimentation est plus défendable.

Ce sont des points de départ, pas des règles permanentes. Revérifiez la morphologie, le temps de doublement, le glucose usé, le lactate et la viabilité après au moins deux passages dans la nouvelle formulation.

Si la culture croît mais que l’essai est instable, ne changez qu’une variable DMEM à la fois. Un passage complet de high glucose, phenol red présent, L-glutamine libre et pyruvate présent à un milieu sans colorant, tamponné HEPES et sans pyruvate peut créer quatre facteurs de confusion en une seule fois.

• Cellules sensibles au pyruvate : commandez un DMEM sans pyruvate, puis ajoutez sodium pyruvate à 0.5 ou 1.0 mM uniquement dans le bras de comparaison.
• Applications d’imagerie sans colorant : choisissez un DMEM sans phenol red et vérifiez le bruit de fond dans le jeu de filtres exact. Pour les rapporteurs verts faibles, cela peut compter plus que le choix du glucose.
• Incubation en low-CO2 ou manipulation ouverte : utilisez 10 à 25 mM HEPES. Confirmez le pH après 60 minutes hors de l’incubateur, avec une cible de 7.1 à 7.4.
• Fenêtres de culture plus longues : utilisez de la glutamine stable lorsque l’essai dépasse 72 heures ou lorsqu’une perte de viabilité sensible à l’ammoniac apparaît.
• Protocoles historiques : faites correspondre la modification ATCC ou le jeu d’acides aminés standard avant d’ajuster les suppléments.

Lors du passage d’un low-glucose DMEM à un high-glucose DMEM, réalisez une adaptation sur deux passages. Pour MRC-5 (ATCC CCL-171), un déplacement osmotique et nutritionnel soudain peut modifier la morphologie avant de modifier la viabilité.

Un laboratoire souhaite un seul DMEM pour la transfection transitoire HEK293T (ATCC CRL-3216) et l’imagerie de cellules vivantes U-2 OS (ATCC HTB-96). Le premier réflexe est un high-glucose DMEM avec phenol red, L-glutamine et sodium pyruvate parce qu’il soutient la croissance. Ce ne sera pas idéal pour l’imagerie.

Séparez le choix en deux milieux. Pour l’expansion et la transfection HEK293T, commencez avec un high-glucose DMEM, 4.5 g/L glucose, glutamine stable, phenol red présent et pyruvate à 1.0 mM. Les contrôles de libération doivent montrer un pH autour de 7.2, une osmolality proche de 300 à 315 mOsmol/kg, endotoxin ≤0.25 EU/mL et mycoplasma non détecté par qPCR.

Pour l’imagerie U-2 OS, choisissez un high-glucose DMEM sans phenol red, ajoutez 10 à 25 mM HEPES si la plaque reste hors 5% CO2, et omettez pyruvate sauf si la biologie l’exige. Dans l’essai de qualification, comparez la confluence à 48 heures, la morphologie et le bruit de fond de fluorescence. Conservez le milieu qui maintient au moins 90% de viabilité et donne le bruit de fond le plus faible dans le canal rapporteur.

Pour la montée en échelle ou la culture dense, la mesure du milieu usé est plus prédictive que la dénomination du catalogue. La littérature sur les procédés CHO et hybridomes montre à plusieurs reprises que glucose, glutamine, lactate et ammonia doivent être balanced together, not selected as separate checkboxes [2] Ozturk SS et al. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002.

1. Eagle H. The specific amino acid requirements of a mammalian cell strain in tissue culture. Science 1955;122(3168):501-514. doi:10.1126/science.122.3168.501
2. Ozturk SS, Palsson BO. Growth, metabolic, and antibody production kinetics of hybridoma cell culture: effects of serum concentration, dissolved oxygen concentration, and medium pH in a batch reactor. Biotechnol Prog 1991;7(6):481-494. doi:10.1021/bp00012a002
3. Altamirano C, Paredes C, Cairo JJ, Godia F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnol Prog 2000;16(1):69-75. doi:10.1021/bp990124j
4. Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Stem Cell Reports 2011;1(1):1-12. doi:10.1016/j.stemcr.2013.05.001

Dois-je choisir un DMEM à 4.5 g/L ou 1.0 g/L glucose pour la transfection HEK293T ?

Quand utiliser un DMEM sans phenol red plutôt qu’un DMEM standard ?

HEPES est-il nécessaire si mon incubateur fonctionne déjà à 5% CO2 ?

Pourquoi commander un DMEM sans sodium pyruvate ?