كيفية اختيار DMEM لخطك الخلوي
يمكن أن تبدو تجربة نقل جيني في HEK293T طبيعية عند 24 ساعة ومع ذلك تفشل في تحقيق العائد عند 72 ساعة إذا كان اختيار DMEM خاطئاً. التقسيم المعتاد هو غلوكوز مرتفع، 4.5 g/L، مقابل غلوكوز منخفض، 1.0 g/L، لكن أحمر الفينول، والبيروفات، وHEPES، وكيمياء الغلوتامين غالباً لا تقل أهمية. يبدأ هذا الدليل بقواعد اختيار عملية، ثم يعرض فحوص ضبط جودة مقاسة مثل pH 7.21، وأسمولالية 312 mOsmol/kg، وحيوية HEK293T بنسبة 96.3% عند 96 ساعة.
المشكلة (مع مثال محدد)
حالة شائعة: تنمو HEK293T (ATCC CRL-3216) جيداً في DMEM مرتفع الغلوكوز أثناء التمرير الروتيني، ثم تنخفض الحيوية من 92% إلى 78% بعد تغيير كاشف أزال بهدوء بيروفات الصوديوم وبدّل الغلوتامين المستقر إلى L-glutamine حر.
هذا ليس فشلاً غامضاً في خط الخلايا. إنه عدم تطابق في التركيبة.
يُحسم اختيار DMEM عادةً عبر ستة أبعاد: مستوى الغلوكوز، وأحمر الفينول، وشكل L-glutamine، وبيروفات الصوديوم، وHEPES، ومجموعة الأحماض الأمينية. يدعم الغلوكوز المرتفع، 4.5 g/L، الخطوط سريعة التحلل السكري والمزارع الكثيفة. وغالباً يكون الغلوكوز المنخفض، 1.0 g/L، نقطة بداية أفضل عندما تُظهر الخلايا تراكم لاكتات، أو تغيراً في الشكل الخلوي، أو قراءات حساسة للاستقلاب.
- الغلوكوز: 4.5 g/L لـ HEK293T (ATCC CRL-3216)، وU-2 OS (ATCC HTB-96)، وكثير من سير العمل عالية الكثافة. 1.0 g/L للدراسات الأبطأ الشبيهة بالأولية أو الحساسة للاستقلاب.
- أحمر الفينول: أبقه للزراعة الروتينية والانحراف المرئي في pH. أزله للتصوير الفلوري، أو الاختبارات الحساسة للهرمونات، أو قراءات المراسل الضعيفة.
- L-glutamine: يُعد L-glutamine الحر تقليدياً، لكن ثنائي ببتيد الغلوتامين المستقر يقلل ارتفاع الأمونيا أثناء التغذيات الأطول.
- بيروفات الصوديوم: مفيد عند 1.0 mM لتلطيف الإجهاد التأكسدي والتعافي. احذفه عندما تؤثر البيروفات في اختبارات التدفق الاستقلابي.
- HEPES: مفيد عند 10 إلى 25 mM للمناولة في CO2 منخفض، والمجهرية، وفترات النقل خارج حاضنة 5% CO2.
- مجموعة الأحماض الأمينية: يناسب DMEM القياسي الصيانة الروتينية، ويساعد تعديل ATCC على مطابقة بروتوكولات بنوك الخلايا القديمة، وتدعم مجموعات الأحماض الأمينية المتقدمة المزارع الأعلى كثافة أو المعرضة للإجهاد.
الآلية (figure 1، figure 2)
الشكل 1، ضغط الغلوكوز واللاكتات. يبدأ DMEM مرتفع الغلوكوز عند 4.5 g/L من الغلوكوز، مما يعطي الخلايا سريعة النمو احتياطياً كربونياً أكبر. والمقايضة هي تكوّن اللاكتات. في مزارع HEK293T (ATCC CRL-3216) أو HeLa (ATCC CCL-2) الكثيفة، يتزامن اللاكتات فوق 20 إلى 25 mM غالباً مع نمو أبطأ، وانحراف pH إلى أقل من 7.0، ونفاد مبكر للوسط.
الشكل 2، كيمياء المحلول المنظم والنيتروجين. صُمم DMEM المنظم بالبيكربونات حول ضبط CO2. يضيف HEPES قدرة تنظيمية أثناء المناولة على الطاولة أو التصوير الحي للخلايا، حيث قد يبقى الطبق في هواء الغرفة لمدة 30 إلى 90 دقيقة. تهم كيمياء الغلوتامين لأن L-glutamine الحر يتحلل أثناء التخزين والزراعة، بينما يمكن للغلوتامين المستقر أن يقلل حمل الأمونيا في تشغيلات 72 إلى 120 ساعة.
تقع البيروفات عند نقطة قرار مختلفة. يمكنها دعم التعافي من الإجهاد التأكسدي وتمنح الخلايا مصدراً كربونياً إضافياً، لكنها يمكن أيضاً أن تحجب الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا. لاختبارات الاستقلاب بنمط قياس التنفس الخلوي، أو تتبع اللاكتات، أو دراسات الاستجابة للبيروفات، ابدأ بـ DMEM خالٍ من البيروفات وأضف البيروفات كمتغير مضبوط.
المنطق الأساسي قديم، لكنه لا يزال مفيداً. أسس عمل إيغل في المغذيات المحددة سبب وجوب التعامل مع الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح والغلوكوز كمتغيرات تجريبية فعالة بدلاً من مكونات خلفية [1] إيغل إتش. العلوم 1955؛122(3168):501-514. المعرّف الرقمي:10.1126/science.122.3168.501.
طرق القياس
لا تختَر DMEM من الاسم وحده. أكد القيم المقاسة للدُفعة، ثم طابقها مع خط الخلايا والاختبار.
| القياس | قيمة الإفراج النموذجية | نطاق القبول | سبب الأهمية |
|---|---|---|---|
| pH عند 20 إلى 25°C | 7.21 | 7.0 إلى 7.4 | يكشف عدم تطابق CO2 والمحلول المنظم قبل بدء الزراعة |
| الأسمولالية | 312 mOsmol/kg | 260 إلى 320 mOsmol/kg | القيم المرتفعة تُجهد MDCK (ATCC CCL-34) وMRC-5 (ATCC CCL-171) |
| السموم الداخلية، اختبار ليمولوس الأميبي | ≤0.25 EU/mL | ≤0.50 EU/mL | مهم للقراءات الالتهابية والظهارية |
| الميكوبلازما، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي | غير مكتشفة | غير مكتشفة | يحمي بيانات معدل النمو والنسخ الجيني |
| العقم | اجتياز دستور الأدوية الأمريكي <71> | لا نمو | مطلوب للإفراج إلى الزراعة الروتينية |
| تعزيز النمو | حيوية HEK293T بنسبة 96.3% عند 96 h | حيوية ≥90.0% | يتحقق من أن التركيبة تدعم خطاً حساساً سريع النمو |
لاختيار الغلوكوز، قِس الوسط المستهلك بعد 48 و72 ساعة. إذا بقي الغلوكوز فوق 1.5 g/L لكن اللاكتات تجاوز 22 mM، فنادراً ما يكون الانتقال إلى كثافة مغذيات أعلى هو الجواب. إذا انخفض الغلوكوز إلى أقل من 0.5 g/L بينما بقيت الحيوية فوق 90%، فإن استراتيجية الغلوكوز المرتفع أو التغذية تكون أكثر قابلية للدفاع عنها.
عتبات التحمل حسب نوع الخلية (جدول)
| خط الخلايا | نقطة البدء النموذجية لـ DMEM | تفضيل الغلوكوز | البيروفات | أحمر الفينول | ملاحظة HEPES |
|---|---|---|---|---|---|
| HEK293T (ATCC CRL-3216) | DMEM مرتفع الغلوكوز مع L-glutamine | 4.5 g/L | اختياري، غالباً 1.0 mM للتعافي | موجود للتمرير الروتيني، وغائب للتصوير | 10 إلى 25 mM إذا غادرت الأطباق CO2 لمناولة النقل الجيني |
| HeLa (ATCC CCL-2) | DMEM مرتفع الغلوكوز، أحماض أمينية قياسية | 4.5 g/L | عادةً ما يكون محتملاً | أزله للعمل الفلوري أو الحساس للإستروجين | مفيد أثناء جلسات المجهرية الأطول من 30 دقيقة |
| MRC-5 (ATCC CCL-171) | DMEM منخفض الغلوكوز أو تعديل قديم مطابق | 1.0 g/L | استخدمه بحذر إذا كانت واسمات الشيخوخة الخلوية مراقبة | موجود لزراعة الأرومات الليفية الروتينية | تجنب الزيادة في المحلول المنظم ما لم تكن المناولة في CO2 منخفض ضرورية |
| Vero (ATCC CCL-81) | DMEM مرتفع الغلوكوز للتوسع | 4.5 g/L | غالباً مفيد أثناء التعافي من الإذابة | موجود ما لم تتطلب نقطة نهاية التصوير وسطاً خالياً من الصبغة | جيد للنقل وإعداد العدوى خارج الحاضنة |
| MDCK (ATCC CCL-34) | DMEM منخفض إلى متوسط الغلوكوز، ضبط أسمولي محكم | 1.0 g/L أولاً، ثم التحسين | يعتمد على الاختبار | أزله لتصوير الحواجز | استخدمه عندما يتجاوز العمل على الأطباق المفتوحة 45 دقيقة |
| HepG2 (ATCC HB-8065) | DMEM مرتفع الغلوكوز مع البيروفات | 4.5 g/L | شائعاً 1.0 mM | غائب لاختبارات الفلورة الاستقلابية | مفيد لأن الاختبارات الكبدية غالباً تتضمن مناولة طويلة |
| U-2 OS (ATCC HTB-96) | DMEM مرتفع الغلوكوز، خيار بدرجة ملائمة للتصوير | 4.5 g/L | اختياري | غائب للفلورة في الخلايا الحية | موصى به للتصوير الزمني خارج 5% CO2 |
| NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) | DMEM مرتفع الغلوكوز للتوسع الروتيني | 4.5 g/L | عادةً ما يكون محتملاً | موجود للصيانة | استخدمه فقط عندما تتطلب ظروف المناولة ذلك |
هذه نقاط بداية، وليست قواعد دائمة. أعد فحص الشكل الخلوي، وزمن التضاعف، والغلوكوز المستهلك، واللاكتات، والحيوية بعد تمريرتين على الأقل في التركيبة الجديدة.
كيفية الحد من التأثيرات
إذا كانت الزراعة تنمو لكن الاختبار غير مستقر، فغيّر متغيرًا واحدًا فقط من متغيرات DMEM في كل مرة. إن الانتقال الكامل من وسط عالي الجلوكوز، مع وجود أحمر الفينول، وL-glutamine حر، ووجود البيروفات إلى وسط خالٍ من الصبغة، ومنظَّم بـ HEPES، وخالٍ من البيروفات يمكن أن يخلق أربعة عوامل مُربِكة دفعة واحدة.
- الخلايا الحساسة للبيروفات: اطلب DMEM خاليًا من البيروفات، ثم أضف بيروفات الصوديوم بتركيز 0.5 أو 1.0 mM في ذراع المقارنة فقط.
- تطبيقات التصوير الخالية من الصبغة: اختر DMEM خاليًا من أحمر الفينول وتحقق من الخلفية في مجموعة المرشحات الدقيقة. بالنسبة للمراسلين الخضر الضعفاء، قد يكون ذلك أهم من اختيار الجلوكوز.
- الحضانة منخفضة CO2 أو التعامل المفتوح: استخدم 10 إلى 25 mM من HEPES. أكّد pH بعد 60 دقيقة خارج الحاضنة، مع هدف يتراوح بين 7.1 و7.4.
- نوافذ زراعة أطول: استخدم glutamine مستقرًا عندما تتجاوز التشغيلية 72 ساعة أو عندما يظهر فقدان في الحيوية حساس للأمونيا.
- البروتوكولات القديمة: طابِق تعديل ATCC أو مجموعة الأحماض الأمينية القياسية قبل تعديل المكمّلات.
عند الانتقال من DMEM منخفض الجلوكوز إلى DMEM عالي الجلوكوز، نفّذ تكيّفًا على مرورين. بالنسبة إلى MRC-5 (ATCC CCL-171)، يمكن للتحول الأسموزي والغذائي المفاجئ أن يغيّر الشكل الخلوي قبل أن يغيّر الحيوية.
مثال عملي
يريد مختبر استخدام نوع واحد من DMEM للترنسفكشن العابر لخلايا HEK293T (ATCC CRL-3216) والتصوير الحيّ لخلايا U-2 OS (ATCC HTB-96). الانطباع الأول هو استخدام DMEM عالي الجلوكوز مع أحمر الفينول وL-glutamine وبيروفات الصوديوم لأنه يدعم النمو. لكن ذلك لن يكون مثاليًا للتصوير.
قسّم الاختيار إلى وسطين. لتوسيع HEK293T والترنسفكشن، ابدأ بـ DMEM عالي الجلوكوز، 4.5 g/L جلوكوز، glutamine مستقر، مع وجود أحمر الفينول، وبيروفات عند 1.0 mM. يجب أن تُظهر فحوص الإفراج pH قريبًا من 7.2، وأسمولية قريبة من 300 إلى 315 mOsmol/kg، وذيفانًا داخليًا ≤0.25 EU/mL، وعدم اكتشاف الميكوبلازما بواسطة qPCR.
لتصوير U-2 OS، اختر DMEM عالي الجلوكوز من دون أحمر الفينول، وأضف 10 إلى 25 mM من HEPES إذا بقيت الصفيحة خارج 5% CO2، واحذف البيروفات ما لم تكن البيولوجيا تحتاج إليه. في تشغيل التأهيل، قارن الالتقاء بعد 48 ساعة، والشكل الخلوي، وخلفية التألق. احتفظ بالوسط الذي يحافظ على حيوية لا تقل عن 90% ويعطي الخلفية الأقل في قناة المراسل.
بالنسبة إلى التوسيع الحجمي أو الزراعة الكثيفة، فإن قياس الوسط المستهلك أكثر قدرة على التنبؤ من تسمية الكتالوج. تُظهر أدبيات عمليات CHO والهجينومة مرارًا أن الجلوكوز وglutamine واللاكتات والأمونيا يجب أن تُوازَن معًا، لا أن تُختار كخانات تحقق منفصلة [2] أوزتورك إس إس وآخرون. التقدم في التكنولوجيا الحيوية 1991؛7(6):481-494. المعرّف الرقمي:10.1021/bp00012a002.
المراجع (مرقمة، مع DOIs)
- إيغل هـ. المتطلبات المحددة من الأحماض الأمينية لسلالة خلايا ثديية في زراعة الأنسجة. العلم 1955؛122(3168):501-514. المعرّف الرقمي:10.1126/science.122.3168.501
- أوزتورك إس إس، بالسون بي أو. حركيات النمو والأيض وإنتاج الأجسام المضادة في زراعة خلايا الهجينومة: تأثيرات تركيز المصل وتركيز الأكسجين المذاب وpH الوسط في مفاعل دفعي. التقدم في التكنولوجيا الحيوية 1991؛7(6):481-494. المعرّف الرقمي:10.1021/bp00012a002
- ألتاميرانو سي، باريديس سي، كايرو جاي جاي، غوديا إف. تحسين صياغة وسط زراعة خلايا CHO: الاستبدال المتزامن للجلوكوز وglutamine. التقدم في التكنولوجيا الحيوية 2000؛16(1):69-75. المعرّف الرقمي:10.1021/bp990124j
- تشين جي، غولبرانسون دي آر، هو زي، بولين جاي إم، روتّي في، بروباسكو إم دي، وآخرون. شروط محددة كيميائيًا لاشتقاق وزراعة iPSC بشرية. تقارير الخلايا الجذعية 2011؛1(1):1-12. المعرّف الرقمي:10.1016/j.stemcr.2013.05.001